HOK人口腔角质细胞源自人口腔黏膜上皮，贴壁生长，具角质化分化、构建黏膜屏障功能，可模拟口腔生理环境，用于口腔黏膜疾病机制、药物毒性评估研究。

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更新时间：2025-11-11

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HOK人口腔角质细胞

一、细胞基本生物学特性

HOK人口腔角质细胞源自健康成人口腔黏膜上皮组织（多取自牙龈、颊黏膜或舌背非角化区，经原代分离、纯化及体外稳定培养建立），是研究口腔黏膜生理功能、黏膜疾病发病机制及口腔相关药物安全性评价的核心体外模型。其保留了正常口腔上皮角质细胞的分化特征与屏障功能，在模拟口腔黏膜微环境、炎症响应及损伤修复过程方面表现稳定，广泛应用于口腔医学、黏膜生物学及药理学领域。

形态上，该细胞呈典型上皮角质细胞形态，不同分化阶段形态存在差异：增殖期细胞呈多边形、短梭形（胞体长 12-18μm，宽 8-14μm），胞质透亮均匀，细胞核大而圆，位于细胞中央，核仁清晰（1 个），染色质呈细颗粒状均匀分布，核分裂象偶见（正常培养条件下分裂象比例约 1%-2%）；诱导分化后细胞逐渐呈扁平状，胞质内出现大量角蛋白丝（HE 染色可见嗜酸性增强），细胞间形成紧密连接，部分细胞出现角化颗粒（PAS 染色阳性率约 40%-50%）。体外培养以贴壁生长为主，接种后 36-48 小时完成贴壁，随培养时间推移形成单层 “铺路石样" 细胞群落，具接触抑制特性（融合度达 80%-90% 时增殖停滞，启动分化程序），可稳定传代 8-12 代，传代至 10 代后仍保持正常上皮细胞表型，无恶性转化特征，符合正常细胞体外研究需求。

功能特性方面，HOK 人口腔角质细胞具备三大核心生理功能。一是角质化分化功能：在含钙离子（1.8-2.0mmol/L）的培养基中可诱导分化，从基底层样细胞逐步分化为棘层、颗粒层细胞，最终形成角质层样结构，分化过程中角蛋白表达谱发生动态变化（如 K14、K5 在增殖期高表达，K1、K10 在分化期高表达），且可合成并分泌角质形成细胞生长因子（KGF）、转化生长因子 -β（TGF-β）等调控自身分化的细胞因子。二是黏膜屏障构建能力：细胞间可形成紧密连接（occludin、claudin-1 等蛋白高表达）与桥粒连接（desmoglein-1、desmocollin-1 阳性），构建物理屏障；同时可分泌黏蛋白（如 MUC1、MUC4）与抗菌肽（如 β- 防御素 2），形成化学防御屏障，体外培养 7-10 天可形成跨上皮电阻（TEER）值≥200Ω・cm² 的完整屏障模型，模拟口腔黏膜的屏障功能。三是炎症与损伤响应能力：对口腔常见致病菌（如变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌）及其毒素（如脂多糖 LPS）具敏感性，1μg/mL LPS 处理 24 小时后，炎症因子 IL-6、TNF-α 表达量升高 4-6 倍，模拟口腔黏膜炎症反应；机械划伤或化学损伤后，细胞可快速迁移修复（划痕愈合实验中 24 小时愈合率达 35%-45%），同时分泌血小板衍生生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）促进损伤修复。

分子表型上，该细胞高表达口腔上皮细胞特异性标志物：角蛋白 14（K14，阳性率≥95%，增殖期上皮细胞标志物）、角蛋白 19（K19，阳性率≥90%，口腔非角化上皮特征蛋白）、紧密连接蛋白 occludin（阳性率≥85%，上皮屏障标志物），其中 K14⁺occludin⁺双阳性表型是其身份鉴定的核心依据；同时表达多种功能相关蛋白，包括分化调控蛋白（involucrin，分化期阳性率≥70%）、炎症响应蛋白（TLR4，阳性率≥80%，介导细菌毒素信号）、修复相关蛋白（EGFR，阳性率≥85%，促进细胞迁移增殖）；细胞内信号通路维持正常上皮细胞稳态：MAPK/ERK 通路（调控细胞增殖与分化，增殖期活性较高）、PI3K/Akt 通路（维持细胞存活与屏障功能，基础活性稳定）、NF-κB 通路（炎症刺激时激活，介导炎症因子分泌）；染色体核型为正常人类二倍体（46,XX/XY），无染色体异常，与体内口腔黏膜上皮细胞分子特征高度一致，确保实验结果的生理相关性。

二、体外培养关键条件

HOK 人口腔角质细胞的体外培养需模拟口腔黏膜微环境，精准控制分化诱导条件，维持其正常生理功能与表型，避免体外培养导致的分化异常或功能丢失。

培养基选择：增殖阶段优先使用专用角质细胞培养基（如 KGM-Gold™培养基）或 DMEM/F12（3:1）混合培养基，添加 0.05-0.1mmol/L 钙、10% 胎牛血清（FBS，低内毒素≤5 EU/mL，无支原体污染）、0.1μg/mL 表皮生长因子（EGF）、5μg/mL 胰岛素，以维持细胞增殖活性；诱导分化时需将培养基钙浓度提升至 1.8-2.0mmol/L，培养 7-10 天启动分化程序；构建屏障模型时需使用 Transwell 小室（孔径 0.4μm），接种密度为 2×10⁵个 / 孔，培养 10-14 天至 TEER 值稳定≥200Ω・cm²。培养基 pH 值控制在 7.2-7.4，渗透压维持在 285-310 mOsm/kg，避免 pH 或渗透压异常导致细胞分化紊乱。

培养环境参数：温度稳定维持在 37℃±0.5℃，CO₂浓度 5%±0.3%，相对湿度 95% 以上；温度波动超过 ±1℃会导致细胞增殖率下降 15%-20%，且分化进程紊乱（如角蛋白表达异常）；CO₂浓度低于 4% 会导致培养基 pH 值升高，细胞出现空泡化；高于 6% 则导致 pH 值降低，细胞活力下降，需通过培养箱实时监控并精准调控。

传代操作要点：细胞融合度达 70%-80%（未启动分化前）时需及时传代，避免过度融合导致分化；操作步骤如下：用无菌 PBS 轻柔清洗细胞 2 次（避免破坏细胞间连接），加入低钙细胞消化液（含 0.02% EDTA，钙浓度 < 0.1mmol/L），37℃孵育 5-8 分钟（正常细胞消化时间较长，需镜下观察至细胞边缘收缩、间隙增大），加入含血清的培养基终止消化，用移液器轻柔吹打至细胞wan全脱落（避免过度吹打导致细胞损伤），按 1:2-1:3 比例接种至新培养皿（预包被 0.1% 胶原 Ⅰ 或纤连蛋白，提升贴壁率）；传代过程中需严格控制消化时间，避免消化过度导致细胞活性丢失，且传代次数不宜超过 12 代（超过 12 代细胞易出现衰老或分化能力下降）。

关键注意事项：细胞对培养基钙浓度高度敏感（钙浓度 <0.1mmol/L 维持增殖，>1.0mmol/L 启动分化），需使用钙浓度精准调控的专用培养基；血清需选择低钙批次（钙浓度 < 1.0mmol/L），避免血清钙干扰细胞分化；培养器皿建议包被 extracellular matrix（ECM）成分（如胶原 Ⅰ、层粘连蛋白），将贴壁率提升至 90% 以上；培养基每 2-3 天更换 1 次（正常细胞代谢较慢，无需频繁换液），更换时轻柔操作，避免冲击细胞单层。

三、核心科研应用领域

口腔黏膜疾病机制研究：可用于解析口腔黏膜炎症、溃疡及癌前病变（如口腔白斑病）的发病机制，如构建 LPS 诱导的口腔黏膜炎模型，研究炎症因子 IL-6、TNF-α 的表达调控机制（沉默 NF-κB 基因后，炎症因子表达量下降 70%，证实 NF-κB 通路的关键作用）；对比正常 HOK 细胞与口腔白斑病患者来源角质细胞的转录组差异，筛选出癌前病变相关基因（如 p53、p16，在病变细胞中表达异常），为明确疾病机制提供直接证据。

口腔黏膜屏障功能研究：可构建体外口腔黏膜屏障模型（Transwell 小室培养），研究屏障功能的调控机制与损伤修复，如检测酒精、酸性物质（如碳酸饮料）对屏障的破坏作用（20% 酒精处理 1 小时后，TEER 值下降 50%，紧密连接蛋白 occludin 表达减少）；评价黏膜保护剂（如含 EGF 的漱口水）对屏障的修复效果（处理 24 小时后，TEER 值恢复至 80%，occludin 表达上调），为口腔黏膜保护产品研发提供依据。

口腔相关药物安全性与有效性评价：适用于口腔局部用药（如漱口水、牙膏成分）的毒性评估，如检测药物成分对细胞活力、屏障功能的影响（通过 MTT 法检测细胞存活率，TEER 法检测屏障完整性），确保药物安全性；同时可评价药物的抗炎、修复效果，如检测中药成分（如甘草酸苷、金银花提取物）对 LPS 诱导的炎症抑制作用（50μmol/L 甘草酸苷处理后，IL-6 表达下降 60%），为天然药物研发提供实验支持。

口腔微生物与宿主互作研究：可用于研究口腔致病菌与宿主上皮细胞的互作机制，如共培养变形链球菌与 HOK 细胞，观察细菌黏附、毒素分泌对细胞的影响（细菌黏附后，细胞 TLR4 表达上调，炎症因子分泌增加）；筛选抑制细菌黏附或毒素作用的抗菌肽（如 β- 防御素 2），体外实验显示 β- 防御素 2 可减少 60% 的细菌黏附，为口腔抗菌治疗提供新靶点。

四、质量控制与使用注意事项

（一）质量控制标准

细胞活力：台盼蓝染色法检测活力≥90%（死细胞比例 < 10%），传代后 24 小时贴壁率≥85%（包被 ECM 后≥90%）；

纯度检测：K14⁺occludin⁺细胞比例≥90%，无成纤维细胞（vimentin 阳性）、内皮细胞（CD31 阳性）等杂细胞污染（通过免疫荧光染色或流式细胞术验证）；

功能验证：钙诱导分化 7 天后，分化标志物 K1、K10 阳性率≥60%；屏障模型 TEER 值≥200Ω・cm²；LPS 处理 24 小时后，IL-6 表达量升高≥4 倍；

污染检测：无细菌、真菌、支原体污染（PCR 法或培养法检测），无病毒（如 EB 病毒、HPV 病毒）污染（通过 RT-PCR 检测病毒基因）；

稳定性检测：传代至 10 代后，仍保持≥85% 的标志物阳性率与稳定的分化、屏障及炎症响应功能，无衰老或异常增殖特征（β- 半乳糖苷酶染色阳性率 < 10%）。

（二）使用注意事项

培养操作：长期培养需每 5 代进行一次表型验证（检测 K14、occludin 表达），避免细胞表型漂移；正常细胞与肿瘤细胞需严格分开培养（避免交叉污染，正常细胞对污染更敏感）；

实验设计：开展分化相关实验时，需设置不同钙浓度对照组，明确钙浓度对实验结果的影响；构建屏障模型时，需每日监测 TEER 值，确保屏障完整性达标后再进行实验；

冻存复苏：冻存需选择对数生长期细胞（活力≥95%，传代 5-8 代），冻存液配方为专用培养基 + 10% DMSO+20% FBS+0.1mmol/L 钙，梯度降温（4℃ 30 分钟→-20℃ 1 小时→-80℃过夜→液氮保存）；复苏时在 37℃水浴中快速融化（1-2 分钟），加入 5 倍体积含 0.1mmol/L 钙的培养基，离心后接种至包被 ECM 的培养皿，复苏后 24 小时内避免换液，提升存活率；