MLE-12小鼠肺上皮细胞，贴壁生长，具肺上皮细胞特征，是肺部生理、肺损伤修复及呼吸系统疾病机制研究与药物筛选的特色模型。

MLE-12小鼠肺上皮细胞

MLE-12小鼠肺上皮细胞是从小鼠肺组织中分离纯化，经永生化处理建立的肺上皮细胞系，其起源于肺 Clara 细胞（即细支气管上皮分泌细胞）。作为肺部细支气管上皮的关键功能细胞模型，MLE-12 保留了体内肺 Clara 细胞的核心形态与功能特征，能模拟肺部生理代谢、肺损伤应答及修复过程，成为研究肺部生理机制、呼吸系统疾病发病原理及相关药物筛选的特色实验模型，为解析肺部疾病分子机制、推动临床治疗方案研发提供了标准化工具。

一、核心生物学特性

MLE-12 细胞具肺 Clara 细胞的典型形态，在倒置显微镜下观察为多边形或不规则铺路石状，细胞质饱满、呈透亮状，细胞核为圆形或椭圆形、位于细胞中央，细胞排列紧密、呈贴壁生长，融合后形成连续的上皮细胞单层，且能自然形成细胞间连接，与体内细支气管上皮细胞的形态结构高度一致。

该细胞稳定表达肺 Clara 细胞特异性标志物： Clara 细胞分泌蛋白（CCSP，又称 CC10，是肺 Clara 细胞的标志性分泌蛋白，参与肺部防御与免疫调节）、细胞角蛋白 18（CK18，上皮细胞骨架核心成分，维持上皮细胞形态），同时表达肺上皮细胞相关表面蛋白（如紧密连接蛋白 occludin，参与上皮屏障构建）；不表达肺巨噬细胞标志物（如 CD68）及肺血管内皮细胞标志物（如 CD31），明确其肺 Clara 上皮细胞的属性。

MLE-12 细胞最核心的功能是模拟肺 Clara 细胞的分泌与防御功能：在标准培养条件下，细胞可持续分泌 CCSP，分泌量约为 10-20ng/10⁶细胞 / 24 小时，且 CCSP 的分泌受炎症因子（如 TNF-α、IL-6）调控 —— 炎症刺激后，CCSP 分泌量显著下降，模拟体内肺部炎症状态下肺 Clara 细胞的功能变化，为研究肺部防御机制提供依据。

此外，细胞还具备肺上皮屏障功能与损伤应答能力：融合后的细胞单层可形成一定的跨上皮电阻值（TEER），对小分子物质具选择性通透能力，模拟肺部上皮屏障的生理功能；当受到肺损伤相关刺激（如高浓度氧、脂多糖 LPS）时，细胞会出现紧密连接破坏、CCSP 分泌减少、细胞凋亡率升高等损伤特征，与体内肺上皮损伤过程高度吻合，为研究肺损伤修复机制提供可控的体外模型。

MLE-12 细胞具一定的 “功能可塑性"：在添加特定诱导因子（如维甲酸）的培养基中培养时，细胞可部分向肺泡 Ⅱ 型上皮细胞分化，表达少量肺泡表面活性物质相关蛋白（如 SP-C），模拟肺部上皮细胞的分化潜能；同时，细胞对肺部微环境相关因子（如成纤维细胞生长因子 FGF）敏感，FGF 可促进细胞增殖与迁移，参与损伤后的修复过程，进一步体现其与体内肺上皮细胞的功能相似性。

二、主要研究应用场景

MLE-12 细胞是解析肺 Clara 细胞生理功能与肺部防御机制的核心工具。例如，通过研究 CCSP 的生理作用，发现 CCSP 可通过抑制炎症信号通路（如 NF-κB），减少炎症因子分泌，进而减轻肺部炎症反应；利用基因敲降技术降低 MLE-12 细胞中 CCSP 的表达后，细胞对炎症刺激的敏感性显著升高，进一步证实 CCSP 在肺部防御中的保护作用。

此外，细胞还用于研究肺部物质代谢机制：通过检测 MLE-12 细胞对肺内代谢底物（如脂质、抗氧化物质谷胱gan肽）的代谢能力，揭示肺 Clara 细胞在肺部物质转运与抗氧化防御中的作用，为理解肺部生理稳态调节提供分子层面的依据。

依托损伤应答特性，MLE-12 细胞广泛用于呼吸系统疾病发病机制研究。在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）研究中，用 LPS 或高浓度氧处理 MLE-12 细胞，可构建肺上皮损伤模型，观察到细胞紧密连接蛋白 occludin 表达下调、TEER 值下降、凋亡相关蛋白（如 Caspase-3）激活，与 ARDS 患者肺上皮损伤特征一致；进一步研究发现，激活 AMPK 信号通路可上调 occludin 表达，减轻细胞损伤，为 ARDS 的靶向治疗提供靶点。

在慢性阻塞性肺疾病（COPD）研究中，通过香烟烟雾提取物（CSE）刺激 MLE-12 细胞，发现 CSE 可抑制细胞增殖、降低 CCSP 分泌，同时促进氧化应激相关蛋白（如 NOX4）表达，揭示香烟烟雾对肺上皮细胞的损伤机制，为 COPD 的预防与治疗提供理论基础。

MLE-12 细胞也用于呼吸系统疾病治疗药物的筛选与评价。在肺损伤修复药物筛选中，将候选药物（如天然提取物、小分子化合物）加入肺损伤模型（如 LPS 损伤模型），通过检测细胞 TEER 值、CCSP 分泌量、细胞凋亡率等指标，评估药物的保护作用；例如，筛选发现某黄酮类化合物可通过激活 Nrf2 抗氧化通路，提高 MLE-12 细胞的抗氧化能力，减少 LPS 诱导的细胞损伤，提示其具潜在治疗肺损伤的活性。

同时，细胞还用于药物肺部毒性评价：检测药物对 MLE-12 细胞增殖、分泌功能及屏障完整性的影响，若药物导致细胞活力下降、CCSP 分泌减少或 TEER 值降低，则提示其可能存在肺部毒性，为药物安全性评估提供数据支持。

三、细胞培养关键要点

MLE-12 细胞需使用专用培养基培养：常规使用含 10% 胎牛血清（FBS，选择低内毒素批次，避免刺激细胞过度分泌炎症因子）、1% 非必需氨基酸、1% 抗菌制剂（预防细菌污染）的 DMEM/F12 混合培养基（1:1 比例），该培养基营养成分均衡，可满足细胞增殖与分泌功能需求。若需诱导细胞分化或模拟特定病理状态，可添加维甲酸（终浓度 1μmol/L）或炎症因子、肺损伤刺激物（如 LPS）。培养基 pH 需严格控制在 7.2-7.4，使用前在 37℃水浴锅中预热至室温，避免低温刺激影响细胞状态。

细胞需置于 37℃、5% CO₂、湿度 95% 以上的恒温培养箱中培养：37℃为细胞代谢与酶活性的最适温度，可维持 CCSP 的正常分泌与上皮屏障功能；5% CO₂通过调节培养基中碳酸氢盐平衡维持 pH 稳定，避免 pH 异常导致细胞形态改变或功能紊乱；95% 湿度可防止培养基蒸发，避免渗透压升高导致细胞脱水。培养过程中需每天观察细胞状态，未融合细胞需保持对数生长期，避免过度密集；融合后的细胞需定期检测 TEER 值，确保屏障功能正常。

传代时机选择细胞融合度达到 80%-90% 时（融合度过高易导致细胞连接紧密，消化困难）：先用无菌 PBS 轻轻洗涤细胞 2 次，去除残留血清与分泌的 CCSP；加入适量细胞消化液，37℃孵育 2-3 分钟（肺上皮细胞对消化液敏感性较低，需观察细胞边缘收缩、间隙增大后终止）；加入含血清的培养基中和消化液，轻柔吹打细胞制成单细胞悬液（避免剧烈吹打导致细胞损伤）；按 1:2-1:3 比例接种到新培养皿，加入新鲜培养基后放回培养箱。

冻存需选用对数生长期且功能稳定的细胞（活率≥90%），冻存液为 90% FBS+10% DMSO（DMSO 需缓慢加入，避免细胞渗透压骤变）；将细胞悬液与冻存液按 1:1 混合均匀，分装至冻存管并标注信息；遵循梯度降温程序：4℃放置 30 分钟→-20℃放置 1 小时→-80℃过夜→转入液氮长期保存。复苏时，冻存管从液氮取出后快速放入 37℃水浴融化（时间不超过 1.5 分钟），加入 5 倍体积预热培养基，1000rpm 离心 5 分钟去除 DMSO，用新鲜培养基重悬细胞后接种，复苏后 48 小时内不换液，让细胞充分贴壁，提高存活率。

四、实验使用注意事项