更新时间：2025-04-09
人可溶性肿瘤坏死因子-1试剂盒，借双抗夹心 ELISA 法测样本中 sTNF-1。从样本准备到结果测定，各环节严谨规范，多要点保障检测精准 。
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样本准备：血清样本采集后，需在 1000×g 的条件下离心 10 分钟，小心分离出血清；血浆样本同样按此离心条件处理，注意要依据不同抗凝剂要求规范采集；细胞培养上清液则需以 1000×g 离心 10 分钟，去除其中的细胞碎片和其他不溶性杂质 。若样本不立即使用，应分成小份，在 - 20℃或 -80℃环境下保存，防止反复冻融，使用前需在室温下缓慢充分解冻并确保均匀 。
试剂准备：从冰箱取出试剂盒后，需将所有试剂在室温下平衡 30 - 60 分钟，使试剂温度与室温一致，并充分混匀 。同时，依据实验所需检测的样本数量，确定酶标板的使用条数，标准品孔和空白孔建议设置复孔，以提高检测结果的准确性与可靠性 。此外，要按照说明书要求，用蒸馏水将浓缩洗涤液准确稀释成工作洗涤液 。
加样：在酶标板上精确设置标准品孔、空白孔与待测样本孔 。向标准品孔中加入 50μL 已稀释好的不同浓度标准品，浓度梯度需严格按照试剂盒说明书进行配置；待测样本孔加入 50μL 处理好的样本；空白孔则不加任何试剂 。加样时，务必使用微量加样器，并确保加样量准确，将样本或标准品加于酶标板孔底部，尽量避免触及孔壁，加样后轻轻振荡酶标板，使液体充分混匀 。
温育与洗涤：加样完成后，用封板膜将酶标板密封，放置在 37℃恒温培养箱中温育相应时间，具体温育时长参照试剂盒说明书 。温育结束后，小心揭去封板膜，甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡 30 - 60 秒后，甩去洗涤液，并用吸水纸拍干，此洗涤操作需重复 4 - 5 次，以确保充分去除未结合物质 。若使用洗板机进行洗涤，需提前按照仪器操作规程进行设置，且洗涤次数应适当增加 1 - 2 次 。
后续反应与检测：每孔加入 100μL HRP 标记的检测抗体，轻轻振荡混匀，再次用封板膜密封，37℃温育 30 分钟 。温育结束后，重复上述洗涤步骤 。接着，每孔依次加入底物 A、B 各 50μL，轻轻振荡混匀，避免产生气泡，37℃避光显色 15 - 20 分钟 。显色反应结束后，迅速向每孔加入 50μL 终止液，加入终止液后应立即使用酶标仪在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值 。依据标准曲线，计算出样本中 sTNF-1 的浓度，若样本进行过稀释，还需乘以相应的稀释倍数得到实际浓度 。
试剂盒中的所有试剂在使用前必须充分平衡至室温，避免因温度差异影响检测结果的准确性 。同时，试剂使用后应及时放回冰箱冷藏保存，防止试剂变质 。
样本采集、处理过程务必严格遵循规范操作，防止样本受到污染或发生溶血、脂血等情况，以免干扰检测结果 。如血清样本应避免溶血，红细胞溶解时释放出的具有过氧化物酶活性的物质，可能会增加以 HRP 为标记的 ELISA 测定中的非特异性显色 。
洗涤过程至关重要，既要确保充分去除杂质和未结合物质，又要避免过度洗涤导致已结合的物质脱落 。洗涤液的配制应准确无误，洗涤次数和时间需严格按照说明书执行 。
加样操作要精准、迅速，尽量缩短各孔之间的加样时间间隔，保证实验条件的一致性 。使用加样器时，需定期校准，确保加样量的准确性 。
显色反应过程需严格控制时间和温度，避免光线直射，以保证显色效果的稳定性 。加入终止液后，应尽快进行 OD 值测定，一般建议在 15 分钟以内完成，防止结果出现偏差 。
实验过程中使用的所有耗材，如酶标板、吸头、试管等，应确保无污染且质量可靠，避免对实验结果造成影响 。
若对检测结果存在疑问或出现异常情况，应及时检查实验操作过程、试剂状态以及仪器性能等，必要时可重复实验进行验证 。
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