HEPG2/ADR人肝癌阿霉su耐药细胞是 HepG2 经阿霉su诱导构建的耐药株，具肝癌特性与阿霉su耐药性，高表达耐药蛋白，用于耐药机制、逆转耐药药物筛选研究。

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更新时间：2025-11-12

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HEPG2/ADR人肝癌阿霉su耐药细胞

一、细胞基本生物学特性

HEPG2/ADR人肝癌阿霉su耐药细胞是通过梯度浓度特定抗肿瘤药物诱导 HepG2 人肝癌细胞，经长期筛选获得的稳定耐药细胞株。该细胞株既保留 HepG2 细胞的肝癌核心特性，又具备对该抗肿瘤药物及多种同类药物的交叉耐药性，是研究肝癌药物耐药机制、逆转耐药药物筛选的关键模型，广泛应用于肿瘤药理学、耐药生物学及临床转化医学领域。

细胞形态在 HepG2 基础上呈现耐药相关表型：贴壁生长呈多角形或梭形，胞体直径 18-28μm，较普通 HepG2 细胞略大；胞质丰富且含大量囊泡结构（电镜下可见，为药物外排相关细胞器），部分细胞胞质内出现该抗肿瘤药物蓄积颗粒（呈红色荧光，荧光强度较 HepG2 细胞低 60% 以上）；细胞核大而不规则，核仁明显，核分裂象比例 2%-4%，增殖速率较 HepG2 细胞慢 15%-20%（每代周期 60-84 小时），体现耐药细胞的生长特性。

核心功能聚焦 “肝癌特性 + 药物耐药" 双维度：一是肝癌病理特征维持，高表达 AFP（≥85%）、CK19（≥80%），低表达 HNF4α（≤30%），可合成白蛋白（8-12μg/10⁶细胞 / 24h）、尿素（≥4μmol/10⁶细胞 / 24h），具备 CYP450 酶活性（正常肝细胞 25%-40%），侵袭率≥18%，与 HepG2 细胞基本一致；二是药物稳定耐药，对该抗肿瘤药物的半数抑制浓度（IC₅₀）为 HepG2 细胞的 15-20 倍（≥2μg/mL），同时对柔红霉su、表柔比星等蒽环类药物存在交叉耐药（IC₅₀升高 10-15 倍），耐药表型经 20 代传代后仍稳定（IC₅₀波动 < 15%）；三是耐药机制模拟，高表达药物外排泵蛋白（P - 糖蛋白 P-gp，阳性率≥90%；多药耐药相关蛋白 MRP1，阳性率≥85%），细胞内该抗肿瘤药物蓄积量较 HepG2 细胞低 70%，同时抗凋亡基因（Bcl-2）表达升高 3-4 倍，凋亡率较 HepG2 细胞低 50%（该抗肿瘤药物处理后），重现肝癌药物耐药的核心机制。

分子表型鉴定明确：除 HepG2 细胞标志物（AFP⁺、CK19⁺、EpCAM⁺）外，新增耐药特异性标志物 ——P-gp（细胞膜阳性率≥90%）、MRP1（细胞膜 / 胞质阳性率≥85%）、乳腺癌耐药蛋白 BCRP（阳性率≥75%）；信号通路中，除 PI3K/Akt/mTOR、Ras/Raf/MEK 通路持续激活外，耐药相关通路（如 NF-κB 通路，磷酸化率≥80%；STAT3 通路，磷酸化率≥75%）亦显著激活；核型为近二倍体（45-49 条染色体），存在耐药相关基因（如 ABCB1，编码 P-gp）扩增，裸鼠接种可形成移植瘤（成瘤率 100%），且移植瘤对该抗肿瘤药物治疗无响应（抑瘤率 < 10%），安全性经验证。

二、体外培养关键条件

在 HepG2 细胞培养基础上，需针对耐药特性优化条件：

培养基配置：采用含 Earle's 盐的 MEM 培养基，添加 10% 胎牛血清（无该抗肿瘤药物残留，白蛋白≤5μg/mL）、1% NEAA、1mM 丙酮酸钠、1% 抗菌试剂，额外添加 0.5μg/mL 该抗肿瘤药物（维持耐药表型，防止耐药性丢失）。pH 严格控制在 7.2-7.4（偏离 0.2 致耐药性下降 30%，P-gp 表达降低 25%），渗透压 280-300mOsm/kg（过高易导致细胞凋亡）。进行药物筛选实验时，需去除培养基中的该抗肿瘤药物，避免干扰药物活性检测；研究耐药逆转时，可在培养基中添加耐药逆转剂（如维拉帕米）。

环境参数：培养箱温度稳定在 37℃±0.5℃（温度波动 ±1℃致细胞增殖率下降 25%，耐药蛋白表达降低 30%），CO₂浓度 5%±0.3%，相对湿度≥95%。无需特殊基质铺板，普通培养皿贴壁率≥85%（较 HepG2 细胞略低）；检测细胞内药物蓄积时，需使用荧光显微镜或流式细胞仪，激发波长 488nm、发射波长 590nm。

传代操作：细胞融合度达 70%-80% 时进行传代（避免过度融合致耐药性波动），操作步骤：①用无菌 PBS 轻柔清洗细胞 2 次（每次 1 分钟，耐药细胞贴壁较牢，避免用力冲洗）；②加入含 EDTA 的细胞消化液，37℃孵育 7-10 分钟（耐药细胞消化时间较 HepG2 细胞长，镜下观察到细胞间隙增大、胞体收缩变圆即可终止）；③加入含血清的培养基终止消化，轻柔吹打细胞（吹打次数≤12 次，避免细胞破碎）；④1000rpm 离心 5 分钟，弃上清后用新鲜培养基重悬；⑤按 1:2-1:4 比例接种（传代比例过低易致细胞密度不足，影响耐药性维持）。

培养注意事项：血清需筛选无药物残留批次（避免干扰耐药性检测）；每 4 天更换一次培养基（耐药细胞代谢较慢，代谢废物积累较少）；每 5 代检测耐药性（IC₅₀测定）与耐药蛋白表达（P-gp、MRP1），确保耐药表型稳定（IC₅₀波动 <20%）；避免长期培养中该抗肿瘤药物浓度过高（>1μg/mL），防止细胞毒性过强导致细胞死亡。

三、核心科研应用领域

肝癌耐药机制研究：可用于解析肝癌药物耐药的分子机制，如通过沉默 ABCB1 基因（编码 P-gp），观察细胞内该抗肿瘤药物蓄积量与 IC₅₀变化，明确药物外排泵的耐药作用；检测耐药细胞中 DNA 损伤修复基因（如 XRCC1）、抗凋亡基因（Bcl-2）的表达差异，揭示非泵耐药机制；通过转录组测序筛选耐药相关差异基因（如 lncRNA、miRNA），构建耐药调控网络，为耐药靶点发现提供依据。

耐药逆转药物筛选：用于体外筛选肝癌耐药逆转剂，评估药物逆转效果：如检测维拉帕米、姜黄素等逆转剂对细胞 IC₅₀的影响（逆转倍数≥5 倍为有效）；观察逆转剂对细胞内该抗肿瘤药物蓄积量的提升作用（流式细胞术检测荧光强度升高≥40%）；检测逆转剂对耐药蛋白表达与活性的抑制效果（Western blot 检测 P-gp 表达降低≥30%），为临床逆转耐药治疗提供候选药物。

药物联合用药研究：探索 “抗肿瘤药物 + 耐药逆转剂"“不同抗肿瘤药物" 的联合用药方案，如研究该抗肿瘤药物与维拉帕米联合使用对细胞增殖的抑制作用（联合用药指数 CI<0.9 为协同作用）；评估索拉非尼等非蒽环类药物对耐药细胞的敏感性（IC₅₀<1μg/mL 为敏感），筛选可克服该抗肿瘤药物耐药的联合治疗方案，为临床用药方案优化提供数据支持。

耐药诊断标志物研发：作为阳性对照细胞，用于肝癌耐药诊断标志物的研发与验证，如验证 P-gp、MRP1 检测抗体的特异性与灵敏度（免疫组化检测阳性率≥90%）；用于循环肿瘤细胞（CTC）耐药表型检测技术的优化，通过模拟耐药 CTC 的生物学特征，评估检测方法对耐药细胞的识别率（≥85%）；研发耐药相关基因检测试剂盒（如 ABCB1 基因扩增检测），为临床耐药诊断提供工具。

四、质量控制与使用注意事项

（一）质量控制标准

细胞活力与纯度：台盼蓝染色检测细胞活力≥85%，传代 24 小时后细胞贴壁率≥85%；流式细胞术检测 AFP⁺细胞≥85%、P-gp⁺细胞≥90%，无成纤维细胞污染（Vimentin⁺细胞 < 3%）、普通 HepG2 细胞污染（IC₅₀<0.5μg/mL 为污染），确保细胞纯度。

功能验证指标：对该抗肿瘤药物的 IC₅₀≥2μg/mL（为 HepG2 细胞的 15-20 倍）；细胞内该抗肿瘤药物蓄积量较 HepG2 细胞低 70% 以上；P-gp、MRP1 阳性率分别≥90%、85%；裸鼠移植瘤对该抗肿瘤药物治疗抑瘤率 < 10%。

稳定性检测：连续传代 20 代，IC₅₀波动 < 20%；耐药蛋白表达（P-gp、MRP1）波动 < 15%；核型无明显变化，ABCB1 基因扩增水平稳定；无该抗肿瘤药物耐药性丢失现象。

（二）使用注意事项

培养管理：每 5 代进行耐药性与耐药蛋白检测，防止耐药表型漂移；该抗肿瘤药物需按浓度定期添加（每代培养基均含 0.5μg/mL），避免耐药性丢失；与普通 HepG2 细胞严格分开培养，使用独立试剂与耗材，防止交叉污染（普通 HepG2 细胞污染会导致 IC₅₀显著降低）。

实验设计规范：开展耐药逆转实验时，需设置普通 HepG2 细胞对照组、耐药细胞对照组、耐药细胞 + 逆转剂组，确保实验重复性；进行 IC₅₀测定时，需设置 5-7 个药物浓度梯度（0.01-10μg/mL），采用 MTT 法或 CCK-8 法检测，确保数据准确性；研究药物外排功能时，需使用 P-gp 特异性抑制剂（如维拉帕米）作为阳性对照，排除非特异性干扰。

冻存与复苏操作：选择对数生长期细胞进行冻存，冻存液为含 10% DMSO、20% FBS、0.5μg/mL 该抗肿瘤药物的 MEM 培养基，采用梯度降温法（4℃30min→-20℃1h→-80℃过夜→液氮保存）；复苏时将冻存管快速放入 37℃水浴 1-2 分钟（耐药细胞复苏活性较低，需快速解冻），离心后用含该抗肿瘤药物的培养基重悬，培养 48 小时后更换培养基，72 小时后检测细胞活力与耐药性。