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更新时间：2025-11-12
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HepG2-RHBV人肝癌细胞株
一、细胞基本生物学特性
HepG2-RHBV人肝癌细胞株是通过基因转染技术，将鸭乙型肝炎病毒（RHBV）基因组导入 HepG2 人肝癌细胞构建而成的稳定细胞株。该细胞株既保留 HepG2 细胞的核心特性，又新增 RHBV 复制能力，是研究乙肝病毒（HBV）相关肝癌发生机制、抗病du药物筛选的关键模型，广泛应用于病毒学、肿瘤学及药理学领域。
细胞形态延续 HepG2 细胞特征，同时具病毒感染相关表型：贴壁生长呈多角形或不规则形，胞体直径 15-25μm，胞质丰富（含肝特异性蛋白颗粒与 RHBV 病毒颗粒，电镜下可见）；细胞核大而不规则，核仁明显，核分裂象比例 3%-5%，体现肿瘤细胞增殖活性。与普通 HepG2 细胞相比，其在特定诱导条件下（如添加乙肝病毒增强子），可出现病毒复制活跃的形态改变，如胞质内病毒颗粒聚集增多。
核心功能聚焦 “肝癌特性 + RHBV 复制" 双维度：一是肝癌病理特征维持，高表达 AFP（≥90%）、CK19（≥85%），低表达 HNF4α（≤30%），可合成白蛋白（10-15μg/10⁶细胞 / 24h）、尿素（≥5μmol/10⁶细胞 / 24h），具备 CYP450 酶活性（正常肝细胞 30%-50%），侵袭率≥20%，与 HepG2 细胞一致；二是RHBV 稳定复制，可持续表达 RHBV 表面抗原（RHBsAg，ELISA 检测浓度≥100IU/L）、e 抗原（RHB eAg，≥50COI），分泌病毒 DNA（≥10⁴copies/mL），且病毒复制可被抗病du药物（如拉mi夫定）抑制，模拟乙肝病毒感染状态；三是HBV 相关肝癌机制模拟，RHBV 基因整合可激活 PI3K/Akt/mTOR、Ras/Raf/MEK 通路（磷酸化率较 HepG2 细胞高 15%-20%），促进细胞异常增殖，重现 HBV 致肝癌的病理过程。
分子表型鉴定明确：除 HepG2 细胞标志物（AFP⁺、CK19⁺、EpCAM⁺）外，新增 RHBV 特异性标志物 ——RHBsAg（细胞膜 / 胞质阳性率≥90%）、RHBcAg（核 / 胞质阳性率≥85%）；信号通路中，除原有通路激活外，HBV 相关信号通路（如 NF-κB 通路，磷酸化率≥70%）亦被激活；核型为近二倍体（44-48 条染色体），含 RHBV 基因整合位点，裸鼠接种可形成移植瘤（成瘤率 100%）且瘤组织中可检测 RHBV 标志物，安全性经验证。
二、体外培养关键条件
在 HepG2 细胞培养基础上，需针对 RHBV 复制优化条件：
培养基配置：采用含 Earle's 盐的 MEM 培养基，添加 10% 胎牛血清（白蛋白≤5μg/mL，无 RHBV 抗体）、1% NEAA、1mM 丙酮酸钠、1% 青mei素 - 链mei素，额外添加 200μg/mL G418（筛选稳定表达 RHBV 的细胞）。pH7.2-7.4（偏离 0.2 致 RHBV 复制下降 25%），渗透压 280-300mOsm/kg。研究病毒复制时，可用无血清培养基饥饿 12 小时；筛选抗病du药物时，需去除 G418。
环境参数：温度 37℃±0.5℃（波动 ±1℃致 RHBV DNA 分泌减少 30%），CO₂5%±0.3%，湿度≥95%。无需特殊铺板，普通培养皿贴壁率≥90%；检测病毒颗粒时，需使用超离管收集上清。
传代操作：融合 80%-90% 时传代，步骤同 HepG2 细胞，但需注意：消化时间控制在 5-7 分钟（避免过度消化致 G418 筛选细胞丢失），传代比例 1:3-1:5（比例过高易致 RHBV 表达不稳定），每代需留样检测 RHBV 标志物（确保细胞株稳定性）。
培养注意事项：血清需筛选无 RHBV 污染批次（避免干扰检测）；每 3 天换液（G418 需每代添加，维持细胞株稳定）；每 5 代检测 RHBV 复制指标（RHBsAg、RHBV DNA）与肝癌特性（AFP、白蛋白），防止 RHBV 基因丢失；避免细胞过度融合（>95% 致病毒分泌下降）。
三、核心科研应用领域
HBV 相关肝癌机制研究：可研究 RHBV 基因整合对肝癌细胞的影响，如通过敲除 RHBV 核心基因，观察细胞增殖、凋亡变化，揭示病毒致瘤机制；检测 RHBV 感染后肝癌驱动基因（如 TERT、MYC）表达变化，筛选 HBV 相关肝癌靶点；模拟 HBV 慢性感染过程，观察细胞从 “病毒感染 - 肝损伤 - 癌变" 的转化时序。
抗 HBV 药物筛选：用于体外筛选抗乙肝病du药物，如检测药物（拉mi夫定、恩ti卡韦）对 RHBsAg、RHBV DNA 分泌的抑制率（IC50 测定）；观察药物对 RHBV 复制关键酶（如 DNA 聚合酶）活性的影响；结合细胞毒性检测（MTT 法），评估药物疗效与安全性，为临床用药提供数据。
乙肝诊断试剂研发：作为阳性对照细胞，用于 RHBV 检测试剂的研发，如验证 RHBsAg、RHBV DNA 检测试剂盒的灵敏度（可稀释至 10IU/L 仍能检出）与特异性（无交叉反应）；用于 HBV 耐药突变检测技术的优化，通过诱导 RHBV 耐药突变，评估检测方法准确性。
肝毒性与抗病毒协同研究：利用其肝特异性功能，研究抗病du药物的肝毒性，如检测药物对白蛋白分泌、CYP450 酶活性的影响；探索 “抗病du药物 + 抗肿瘤药物" 联合用药效果，评估协同抑制病毒复制与肝癌细胞增殖的作用，为临床联合治疗方案提供依据。
四、质量控制与使用注意事项
（一）质量控制标准
细胞活力与纯度：台盼蓝活力≥90%，贴壁率≥90%；流式检测 AFP⁺≥90%、RHBsAg⁺≥90%，无成纤维细胞（Vimentin⁺<3%）、无关病毒污染（HIV、HCV⁻）。
功能验证：RHBsAg≥100IU/L、RHBV DNA≥10⁴copies/mL；白蛋白≥10μg/10⁶细胞 / 24h；裸鼠成瘤率 100%，瘤组织 RHBV⁺。
稳定性检测：连续传代 20 代，RHBV 标志物表达波动 < 20%；核型无明显变化，RHBV 基因整合位点稳定；无 G418 耐药细胞污染。
（二）使用注意事项
培养管理：每 5 代验证 RHBV 稳定性（防止基因丢失）；G418 需按浓度添加（过高致细胞毒性，过低致杂细胞增殖）；与普通 HepG2 细胞分开培养，避免交叉污染。
实验设计：药物筛选需设阳性对照（拉mi夫定）、阴性对照（培养基）；检测病毒时，需设置无 RHBV 的 HepG2 细胞对照（排除细胞本身干扰）；基因编辑实验后，需验证 RHBV 表达是否受影响。
冻存与复苏：冻存液含 10% DMSO、20% FBS、200μg/mL G418；复苏后培养 24 小时添加 G418，72 小时检测 RHBV 活性；冻存细胞需每代留样，确保细胞株备份。
安全防护：虽 RHBV 对人致病性低，但仍需遵守生物安全二级规范；废弃培养物用 0.5% 次氯酸钠处理 30 分钟；实验人员需戴手套，避免接触病毒上清；细胞株需专人管理，防止滥用。
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