HLF-a人肺细胞源自人肺组织，贴壁生长，具肺成纤维细胞特征，可参与肺组织修复与纤维化过程，用于肺纤维化机制、药物干预及肺疾病模型构建研究。

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更新时间：2025-11-12

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HLF-a人肺细胞

一、细胞基本生物学特性

HLF-a人肺细胞源自健康人肺组织，经原代分离纯化获得，属正常肺成纤维细胞系，保留肺成纤维细胞的典型形态与功能特征，无永生化改造，具有限增殖能力（传代次数约 30-40 代），是研究肺组织修复、肺纤维化机制、肺部炎症微环境调控及呼吸系统疾病的核心体外模型。其在模拟肺成纤维细胞活化、胶原合成及与肺上皮细胞互作方面表现稳定，广泛应用于呼吸病学、病理生理学、药理学及毒理学领域。

形态上，该细胞呈典型成纤维细胞形态：常规培养时以长梭形为主，贴壁生长且呈 “放射状" 或 “漩涡状" 排列（细胞间连接松散，无明显上皮样紧密排列特征），胞体直径 15-20μm；胞质丰富，呈弱嗜碱性（HE 染色呈淡蓝色），含大量粗面内质网与高尔基体（光学显微镜下可见胞质颗粒感，参与胶原等 extracellular matrix 合成）；细胞核呈长椭圆形，位于细胞中央或偏位，核仁 1 个（清晰可见），染色质呈细颗粒状均匀分布，核分裂象偶见（正常培养条件下分裂象比例约 2%-3%，增殖活性适中）。体外培养过程中，细胞形态随活化状态变化：静息状态下细胞细长、排列规则；受刺激（如 TGF-β）活化后，细胞变短粗、胞质增多，呈 “肌成纤维细胞" 样改变（α-SMA 表达上调），符合肺成纤维细胞在病理状态下的表型转化特征，确保实验结果与体内生理病理过程的相关性。

功能特性方面，HLF-a 人肺细胞具备三大核心生理功能，高度模拟体内肺成纤维细胞的生物学行为。一是extracellular matrix（ECM）合成与代谢：可大量合成并分泌胶原（如胶原 Ⅰ、胶原 Ⅲ，胶原 Ⅰ 分泌量约 200-300ng/10⁶细胞 / 24 小时）、纤连蛋白、层粘连蛋白等 ECM 成分，参与肺组织基质构建；同时表达 ECM 降解相关酶（如 MMP-1、TIMP-1，MMP-1 活性可调节胶原降解平衡），在肺组织修复中维持 ECM 动态稳定；受 TGF-β（5ng/mL）刺激后，胶原 Ⅰ 表达量上调 2-3 倍，模拟肺纤维化过程中 ECM 过度沉积。二是肺组织修复与炎症响应：可响应损伤信号（如 PDGF、EGF），迁移至损伤部位参与修复（划痕愈合实验中 24 小时愈合率达 40%-50%）；对肺部炎症因子（如 IL-1β、TNF-α）敏感，10ng/mL IL-1β 处理 24 小时后，炎症因子 IL-6、IL-8 表达量升高 5-7 倍，同时分泌趋化因子（如 CXCL12）招募免疫细胞，参与炎症微环境调控。三是细胞间互作功能：可与肺上皮细胞（如 HL 人胚肺二倍体细胞）共培养，通过旁分泌信号（如 KGF、TGF-β）调控上皮细胞增殖与分化；在共培养模型中，HLF-a 细胞可促进上皮细胞屏障功能修复（TEER 值提升 30%-40%），模拟肺组织细胞间的协同作用。

分子表型上，该细胞高表达肺成纤维细胞特异性标志物：波形蛋白（Vimentin，胞质阳性，阳性率≥95%，成纤维细胞 lineage 标志物）、α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA，静息状态下阳性率 10%-20%，活化后升至 60%-70%，肌成纤维细胞转化标志物）、成纤维细胞特异性蛋白 1（FSP-1，胞质阳性，阳性率≥90%），其中 Vimentin⁺FSP-1⁺双阳性是其身份鉴定的核心依据；同时表达 ECM 合成相关分子（如胶原 Ⅰα1，COL1A1，胞质阳性，阳性率≥90%）、细胞因子受体（如 PDGFR-β，细胞膜阳性，阳性率≥85%，介导增殖与迁移信号）；细胞内信号通路维持成纤维细胞功能平衡：PI3K/Akt 通路（调控细胞存活与迁移，基础活性稳定）、Smad 通路（TGF-β 刺激后激活，调控胶原合成与活化）、MAPK/ERK 通路（炎症刺激或生长因子作用下激活，促进细胞增殖）；无致瘤性（端粒酶活性阴性，裸鼠接种后无肿瘤形成），遗传背景稳定（核型为 46,XX/XY 正常二倍体，染色体畸变率 < 1%）。

二、体外培养关键条件

HLF-a 人肺细胞的体外培养需重点维持其成纤维细胞表型、ECM 合成能力及炎症响应特性，避免培养条件不当导致细胞活化异常或功能丢失。

培养基选择：优先使用 DMEM 高糖培养基（添加 4.5g/L 葡萄糖，满足成纤维细胞高代谢需求）、10% 胎牛血清（FBS，低内毒素≤5 EU/mL，无支原体污染，建议选择未热灭活血清，保留血清中生长因子活性）、1% 非必需氨基酸（NEAA）、100U/mL 青mei素 - 链mei素；培养基 pH 值控制在 7.2-7.4，渗透压 290-320 mOsm/kg。开展纤维化相关实验时，需使用含 2% FBS 的低血清培养基饥饿处理 12-24 小时（减少血清干扰，确保刺激信号特异性）；进行细胞共培养时，需使用无血清培养基（避免血清成分影响细胞间信号传递）。

培养环境参数：温度稳定维持在 37℃±0.5℃，CO₂浓度 5%±0.3%，相对湿度 95% 以上；温度波动超过 ±1℃会导致细胞增殖率下降 18%-25%，胶原合成量减少 30%-40%；CO₂浓度低于 4% 会导致培养基 pH 值升高，细胞出现空泡化；高于 6% 则导致 pH 值降低，细胞活力下降，需通过培养箱实时监控调整；模拟低氧肺环境时，可将氧气浓度降至 5%（常规为 21%），观察低氧对细胞活化的影响（如 α-SMA 表达上调）。

传代操作要点：细胞融合度达 80%-90% 时需及时传代（避免过度融合导致细胞接触抑制，影响增殖与功能）；操作步骤：用无菌 PBS 快速清洗细胞 1 次（成纤维细胞贴壁较牢，无需轻柔），加入 0.25% 胰dan白酶 - 0.02% EDTA 消化液，37℃孵育 3-5 分钟（镜下观察至细胞边缘收缩、间隙增大），加入含血清的培养基终止消化，用移液器吹打至细胞wan全脱落（成纤维细胞耐受性较强，可适度吹打），按 1:3-1:5 比例接种至新培养皿（无需包被，成纤维细胞可直接贴壁，贴壁率≥95%）；传代过程中需控制消化时间（避免消化过度导致细胞损伤，影响迁移能力），且传代次数不宜超过 35 代（超过后细胞可能出现衰老，胶原合成能力下降）。

关键注意事项：细胞对血清批次敏感（不同批次血清可能导致 α-SMA 基础表达波动 20%-25%，胶原 Ⅰ 合成差异 30%），首ci使用新批次血清需进行小体积验证（检测细胞活力、Vimentin 表达及胶原分泌量，确保与原批次差异 < 15%）；培养过程中避免频繁换液（每 3-4 天更换 1 次即可，频繁换液会丢失细胞分泌的生长因子）；成纤维细胞易贴壁生长，传代时需确保细胞wan全脱落（避免残留细胞影响后续培养）；若需长期培养，建议在 10-20 代时大量冻存（每支冻存细胞数≥1×10⁶个），保证实验材料一致性。

三、核心科研应用领域

肺纤维化机制研究：是解析肺纤维化病理过程（如成纤维细胞活化、ECM 过度沉积）的理想模型，如研究 TGF-β/Smad 通路对细胞活化的调控（沉默 Smad3 基因后，α-SMA 表达下降 70%，胶原 Ⅰ 合成减少 60%，证实该通路的关键作用）；筛选纤维化相关差异基因（如通过转录组测序发现 COL1A1、TGF-β1 在纤维化模型中高表达）；验证抗纤维化药物靶点（如抑制 PDGFR-β 可减少细胞迁移与胶原合成，肺纤维化程度减轻），为特发性肺纤维化（IPF）等疾病的机制解析与治疗提供依据。

肺组织修复与炎症研究：可构建肺损伤修复模型（如机械划伤或 H₂O₂诱导损伤），观察细胞迁移与 ECM 合成的动态变化（损伤后 24 小时，PDGFR-β 表达上调，细胞迁移速率提升 50%）；研究炎症因子对细胞功能的影响（如 TNF-α 处理后，细胞分泌 IL-6 增加，同时 MMP-1 活性上调，ECM 降解增强）；探索免疫细胞与成纤维细胞的互作（如与巨噬细胞共培养，巨噬细胞分泌的 IL-1β 可促进 HLF-a 细胞活化，形成炎症 - 纤维化恶性循环）。

抗纤维化与呼吸系统药物筛选：适用于抗肺纤维化药物（如吡非ni酮、尼达尼布）、抗炎药物的体外活性评估，如检测药物对 HLF-a 细胞胶原合成的抑制作用（10μmol/L 吡非ni酮处理后，胶原 Ⅰ 表达下降 45%，α-SMA 阳性率降低 35%）；评价药物对细胞炎症响应的调控效果（50μmol/L 抗炎药物处理后，IL-6 表达量下降 60%）；通过划痕实验检测药物对细胞迁移的影响（药物处理后 24 小时愈合率从 50% 降至 20%，提示抗修复过度作用）。

肺疾病模型构建与毒理学评估：可构建吸烟相关肺损伤模型（如用香烟提取物 CSE 处理细胞），观察细胞氧化应激与活化变化（CSE 处理后，ROS 水平升高 2 倍，α-SMA 表达上调）；用于环境污染物（如 PM2.5、甲醛）的肺毒性评估（检测污染物对细胞活力、胶原合成的影响，如 PM2.5 处理后细胞存活率下降 30%，炎症因子分泌增加）；构建肺纤维化 - 肿瘤共模型（与肺癌细胞共培养），研究纤维化微环境对肿瘤进展的影响（HLF-a 细胞分泌的 CXCL12 可促进肺癌细胞迁移）。

四、质量控制与使用注意事项

（一）质量控制标准

细胞活力与表型：台盼蓝染色法检测活力≥90%，传代后 24 小时贴壁率≥95%；流式细胞术检测 Vimentin⁺FSP-1⁺细胞比例≥90%，α-SMA（静息态）阳性率 10%-20%，无上皮细胞（CK8/18 阳性率 < 1%）或内皮细胞（CD31 阳性率 < 1%）污染。

功能验证：TGF-β（5ng/mL）处理后，α-SMA 阳性率升至≥60%，胶原 Ⅰ 表达量上调≥2 倍；划痕愈合实验 24 小时愈合率≥40%；IL-1β（10ng/mL）处理后，IL-6 表达量升高≥5 倍。

遗传与安全性：染色体核型分析为 46,XX/XY 正常二倍体，畸变率 < 1%；STR 分型与标准 HLF-a 细胞图谱一致性≥95%（避免交叉污染）；端粒酶活性检测为阴性，裸鼠接种无肿瘤形成（排除致瘤性）。

污染检测：无细菌、真菌、支原体污染（PCR 法或培养法检测）；无病毒（如 HIV、HBV、HCV）污染（RT-PCR 检测病毒基因）。

（二）使用注意事项

培养操作：长期培养需每 5 代进行一次表型验证（检测 Vimentin、α-SMA 表达），避免细胞表型漂移（如自发活化）；与肺上皮细胞、内皮细胞分开培养（使用独立培养箱与试剂，防止交叉污染）；传代时严格记录传代次数，优先使用 10-25 代细胞（功能zui稳定）。

实验设计：开展纤维化实验时，需设置空白对照组、TGF-β 阳性对照组及药物组，明确药物对细胞活化的抑制效果；进行炎症实验时，需设置未刺激对照组，排除细胞基础炎症水平干扰；共培养实验需设置单种细胞对照组，区分细胞自身与互作产生的效应。

冻存复苏：冻存需选择对数生长期细胞（活力≥95%，传代 10-20 代），冻存液配方为 DMEM 高糖培养基 + 10% DMSO+20% FBS，梯度降温（4℃ 30 分钟→-20℃ 1 小时→-80℃过夜→液氮保存）；复苏时在 37℃水浴中快速融化（1 分钟内），加入 10 倍体积预热的 DMEM 培养基，1000rpm 离心 5 分钟，弃上清后重悬接种，复苏后 24 小时检测活力（需≥80%），48 小时后再进行实验（确保细胞恢复功能）。