人肝癌细胞多源自人肝癌组织，贴壁生长，具恶性增殖、侵袭及耐药性，可模拟肝癌病理，用于肝癌发病机制、药物筛选及治疗方案优化研究。

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更新时间：2025-11-11

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人肝癌细胞

一、细胞基本生物学特性

人肝癌细胞多源自人原发性肝细胞癌组织（取自不同临床分期肝癌患者手术标本，经原代分离、纯化及稳定传代建立，常见细胞系如 HepG2、Huh7、SMMC-7721 等），是研究肝癌发生发展机制、侵袭转移规律及抗肝癌药物研发的核心体外模型。其保留了肝癌的典型恶性表型与肝细胞功能特征，在模拟肝癌病理进程、药物响应及肝微环境互作方面表现稳定，广泛应用于肿瘤学、肝脏生物学及药理学领域。

形态上，不同细胞系虽略有差异，但整体呈典型恶性肝细胞形态：常规培养时以多边形、上皮样为主，部分细胞呈梭形（胞体长 15-22μm，宽 10-16μm）；胞质丰富且质地不均，含少量脂滴或糖原颗粒（PAS 染色阳性率约 25%-35%，提示保留部分肝细胞代谢功能），细胞间连接松散（缺乏正常肝细胞的胆小管结构，黏附能力弱）；细胞核大而畸形，呈多形性（圆形、椭圆形或不规则形），核仁增多（1-3 个）且明显，染色质浓集呈块状或边集，核分裂象多见（正常培养条件下分裂象比例约 5%-8%，可见病理性核分裂）。体外培养以贴壁生长为主，接种后 24-48 小时完成贴壁，随培养时间推移形成单层或多层细胞群落，无接触抑制（融合度达 100% 仍持续增殖），可稳定传代 30-50 代以上，传代过程中恶性表型与肝细胞特征无明显改变，符合肿瘤细胞系的长期研究需求。

功能特性方面，该细胞具备三大核心恶性特征。一是恶性增殖能力：细胞周期进程异常（G1 期比例降至 40%-45%，S 期比例升至 28%-35%），倍增时间短（不同细胞系略有差异，约 24-48 小时，如 HepG2 倍增时间约 36 小时），无需外源生长因子即可快速增殖，对营养剥夺耐受性强（葡萄糖浓度降至 5mmol/L 时，增殖率仅下降 10%-15%，显著低于正常肝细胞）。二是侵袭转移潜能：体外 Transwell 实验中 24 小时穿膜细胞数达 70-120 个 / 视野（正常肝细胞 < 3 个 / 视野），可分泌高活性基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9，表达量比正常肝细胞高 4-6 倍），高效降解肝窦基底膜成分（如胶原 Ⅳ、层粘连蛋白）；划痕愈合实验中 24 小时愈合率达 55%-70%，模拟肝癌细胞对肝组织的局部侵袭过程，部分高转移潜能细胞系（如 MHCC97H）还可通过尾静脉注射建立肺转移模型。三是肝微环境适应与代谢重塑能力：可分泌肝癌相关蛋白（如甲胎蛋白 AFP、异常凝xue酶原 PIVKA-II，保留部分肝细胞合成功能）与血管生成因子（如 VEGF，表达量比正常肝细胞高 7 倍以上），促进肿瘤血管生成；对hua疗药物（如索拉非尼）具不同程度耐药性，10μmol/L 索拉非尼处理 48 小时后，耐药细胞系（如 Huh7-R）存活率仍达 40%-50%（敏感细胞系存活率 < 20%），同时可通过糖酵解途径重塑能量代谢（糖酵解速率比正常肝细胞高 2-3 倍），适应缺氧肿瘤微环境。

分子表型上，该细胞高表达肝癌特异性标志物：甲胎蛋白（AFP，阳性率因细胞系而异，HepG2 阳性率≥85%，SMMC-7721 阳性率≥70%，肝癌诊断相关蛋白）、细胞角蛋白 18（CK18，阳性率≥90%，上皮源性肿瘤标志物）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3（GPC3，阳性率≥75%，肝癌特异性抗原），其中 AFP⁺GPC3⁺双阳性表型是部分细胞系身份鉴定的核心依据；同时表达多种恶性相关蛋白，包括增殖相关蛋白（Ki-67，阳性率≥65%，提示高增殖活性）、侵袭相关蛋白（MMP-9，细胞膜及胞质阳性）、耐药相关蛋白（ABCB1、ABCG2，阳性率≥55%，介导药物外排）；细胞内信号通路异常激活：PI3K/Akt/mTOR 通路（持续高活性，调控恶性增殖与代谢重塑）、MAPK/ERK 通路（过度激活，促进细胞侵袭与耐药）、Wnt/β-catenin 通路（持续激活，介导肝癌细胞干性维持）；染色体核型为非整倍体（不同细胞系染色体数目差异较大，如 HepG2 多为 55-57 条染色体，可见染色体缺失、易位及扩增，如 11 号染色体部分扩增），与临床肝癌组织的分子特征高度一致，确保实验结果的临床相关性。

二、体外培养关键条件

该细胞的体外培养需兼顾其恶性增殖特性与肝细胞功能特征，精准控制培养条件以维持稳定表型，不同细胞系培养条件略有差异，以下为通用参考标准。

培养基选择：增殖阶段优先使用 DMEM 培养基（高糖型，葡萄糖浓度 4.5g/L）或 RPMI-1640 培养基，添加 10%-15% 胎牛血清（FBS，低内毒素≤5 EU/mL，无支原体污染）、1% 非必需氨基酸（NEAA）、100U/mL 青mei素 - 链mei素（可选，根据污染控制需求），部分细胞系（如 HepG2）可添加 1% 谷an酰胺以维持代谢功能；培养基 pH 值控制在 7.2-7.4，渗透压维持在 290-320 mOsm/kg。构建耐药模型时，可逐步提高药物浓度（如索拉非尼从 0.5μmol/L 增至 10μmol/L，每代培养 2-3 周）；开展肝特异性功能实验（如尿素合成）前，需用含 2% FBS 的培养基饥饿处理 12 小时，消除血清对代谢功能的干扰。

培养环境参数：温度稳定维持在 37℃±0.5℃，CO₂浓度 5%±0.3%，相对湿度 95% 以上；温度波动超过 ±1℃会导致细胞增殖率下降 20%-25%，但肝癌特异性标志物（如 AFP）表达无明显改变；CO₂浓度异常（<4% 或> 6%）会导致培养基 pH 值失衡，细胞出现空泡化（存活率下降），需通过培养箱实时监控调整，部分模拟缺氧微环境的实验可将 CO₂浓度维持在 5%、O₂浓度降至 1%-5%。

传代操作要点：细胞融合度达 70%-80% 时需及时传代（避免过度融合导致细胞脱落与表型改变），操作步骤如下：用无菌 PBS 快速清洗细胞 1-2 次（去除残留血清，避免影响消化效率），加入细胞消化液（37℃孵育 2-4 分钟，不同细胞系消化时间差异较大，如 Huh7 消化时间约 2 分钟，SMMC-7721 约 3-4 分钟），显微镜下观察到细胞变圆、间隙增大时，加入 5 倍体积含血清培养基终止消化，用移液器轻柔吹打至细胞wan全脱落（避免过度吹打导致细胞损伤），按 1:3-1:5 比例接种至新培养皿；传代过程中需根据细胞贴壁能力调整接种密度，贴壁能力弱的细胞系（如 MHCC97H）可适当提高接种密度。

关键注意事项：细胞对血清质量敏感度较高（不同批次血清可能导致 AFP 表达波动 15%-20%），建议选择经验证的低内毒素批次并长期使用；培养器皿无需包被（多数细胞系可直接贴壁，部分贴壁能力弱的细胞系可使用胶原包被培养皿）；培养基每 2-3 天更换 1 次（细胞代谢快，需及时清除代谢废物），更换时可全量更换（无需保留旧培养基，肿瘤细胞无需依赖微环境因子），若观察到细胞出现空泡化或生长缓慢，需及时更换血清或调整培养条件。

三、核心科研应用领域

肝癌发病机制研究：可用于解析肝炎 - 肝硬化 - 肝癌进展机制，如通过 HBV/HCV 病毒基因转染构建病毒相关肝癌模型，研究病毒蛋白（如 HBx）对 Wnt/β-catenin 通路的激活作用（转染后 β-catenin 核定位率提升 40%，细胞增殖率提升 35%）；对比不同分化程度肝癌细胞系（如高分化 HepG2、低分化 SMMC-7721）的转录组差异，筛选出肝癌恶性进展相关基因（如 TERT、MYC，在低分化细胞中高表达），为明确癌变机制提供直接证据。

肝癌侵袭与转移机制研究：可构建体外肝侵袭模型（Transwell 小室加肝窦内皮细胞单层），研究肿瘤细胞与肝微环境的互作，如加入肝星状细胞条件培养基后，肝癌细胞穿膜数提升 2 倍，证实肝纤维化微环境对侵袭的促进作用；通过基因编辑技术（如 CRISPR/Cas9）敲除转移相关基因（如 MMP-9），观察到细胞体外侵袭能力下降 65%，体内肺转移灶数量减少 70%，揭示基因对转移的调控作用。

抗肝癌药物筛选与评价：适用于高通量筛选hua疗药物、靶向药物及中药活性成分，如检测靶向 VEGF 的单抗药物对肝癌细胞的抑制作用（10μg/mL 抗体处理 48 小时后，细胞增殖率下降 60%，VEGF 分泌量下降 80%）；评价药物耐药机制，如检测 ABCB1 抑制剂对索拉非尼耐药细胞的逆转作用（抑制剂处理后，耐药细胞存活率从 45% 降至 18%），同时可通过 3D 培养模型（如类器官培养）模拟体内肿瘤结构，提高药物筛选准确性。

肝癌诊断标志物与治疗靶点验证：可验证肿瘤标志物的临床价值，如检测不同肝癌细胞系分泌的 AFP、PIVKA-II 含量（低分化细胞系分泌量比高分化细胞系高 2-3 倍），对比肝癌患者血清与健康人血清的标志物差异，优化诊断阈值；通过体内外实验验证潜在治疗靶点（如 GPC3），靶向 GPC3 的 CAR-T 细胞处理后，肝癌细胞体外杀伤率达 75%，体内肿瘤体积缩小 60%，提示其作为治疗靶点的潜力。

四、质量控制与使用注意事项

（一）质量控制标准

细胞活力：台盼蓝染色法检测活力≥90%（死细胞比例 < 10%），传代后 24 小时贴壁率≥85%（贴壁能力弱的细胞系≥75%）；

纯度检测：AFP⁺GPC3⁺（或 CK18⁺）细胞比例≥80%，无成纤维细胞、内皮细胞等杂细胞污染（通过免疫荧光染色或流式细胞术验证）；

功能验证：Transwell 实验 24 小时穿膜细胞数≥70 个 / 视野（高转移潜能细胞系≥100 个 / 视野），AFP 分泌量≥10ng/10⁶细胞 / 24 小时（AFP 阳性细胞系），10μmol/L 索拉非尼处理 48 小时后敏感细胞系存活率≤20%、耐药细胞系≥40%；

污染检测：无细菌、真菌、支原体污染（PCR 法或培养法检测），STR 分型与标准细胞系图谱一致性≥95%（避免交叉污染，如 HepG2 标准 STR 分型需与 ATCC 数据库匹配）；

稳定性检测：传代至 30 代后，仍保持≥75% 的标志物阳性率与稳定的侵袭、耐药及代谢功能。

（二）使用注意事项

培养操作：长期培养需每 10 代进行一次 STR 分型验证（肝癌细胞易发生遗传漂变，尤其是耐药细胞系）；不同细胞系需分开培养（避免交叉污染，如 AFP 阳性与阴性细胞系不可共用培养试剂）；

实验设计：开展药物筛选时，需设置正常肝细胞（如 LO2）对照组，评估药物的肿瘤特异性（避免筛选出对正常肝细胞有毒性的药物）；检测侵袭能力时，需统一基质胶浓度（50μg / 孔）与细胞接种密度（1×10⁵个 / 孔），确保结果可重复；

冻存复苏：冻存需选择对数生长期细胞（活力≥95%），冻存液配方为培养基 + 10% DMSO+20% FBS（部分细胞系可添加 10% 甘油提升存活率），梯度降温（4℃ 30 分钟→-20℃ 1 小时→-80℃过夜→液氮保存）；复苏时在 37℃水浴中快速融化（1 分钟内），加入 5 倍体积含血清培养基，离心后缓慢接种（避免剧烈震荡导致细胞损伤）；