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更新时间：2025-10-29
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人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞
人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞，是从人恶性非霍奇金淋巴瘤患者体内分离并经体外永生化建立的自然杀伤（NK）细胞系。该细胞完整保留了 NK 细胞的核心功能特征，如不依赖抗原预先致敏即可高效杀伤肿瘤细胞、分泌多种免疫调节因子，同时具备稳定的体外增殖特性，在肿瘤免疫机制解析、肿瘤杀伤实验研究及过继免yi治疗相关技术研发中占据关键地位，为肿瘤免疫领域的基础研究与临床转化提供了重要实验载体。
一、核心生物学特性
（一）组织来源与细胞属性
NK-92 细胞源自人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的外周血或骨髓中的 NK 细胞群体，与正常 NK 细胞的功能属性高度契合。作为天然免疫系统的核心效应细胞，其拥有典型的 NK 细胞形态特征：细胞呈圆形或不规则形，直径约 12-15μm，胞质丰富且含大量嗜天青颗粒（内含穿孔素、颗粒酶等杀伤相关物质）；细胞核呈圆形或椭圆形，核仁清晰可见，染色质分布均匀。此外，细胞虽源自淋巴瘤患者，但经筛选纯化后无肿瘤细胞的恶性增殖与侵袭特性，仅保留 NK 细胞的免疫效应功能，可长期稳定传代（50 代以内功能无显著退化），是研究 NK 细胞功能的理想模型。
（二）形态与生长特征
体外培养时，NK-92 细胞以悬浮生长为主，无贴壁倾向，部分细胞会形成松散的小细胞团（直径通常不超过 10 个细胞），但不影响细胞活性。细胞形态均一，呈圆形或短梭形，胞质透明，可观察到明显的嗜天青颗粒；分裂象频繁，符合免疫细胞的增殖特征。细胞增殖能力旺盛，倍增时间约 24-36 小时，传代时需严格控制细胞密度，避免密度过高（超过 2×10⁶ cells/mL）导致营养不足引发凋亡，或密度过低（低于 5×10⁵ cells/mL）导致增殖速率下降。常规接种密度以 8×10⁵-1×10⁶ cells/mL 为宜，接种后 12 小时进入对数生长期，24-48 小时可达到传代密度，需规律传代以维持细胞活性。
（三）分子表型与功能特性
分子层面，NK-92 细胞呈现典型的 NK 细胞特异性表型：一是高表达 NK 细胞活化标志物，如 CD56（NK 细胞特征性表面分子）、CD16（Fc 受体，介导抗体依赖的细胞毒性作用 ADCC），其中 CD56 阳性率达 95% 以上，CD16 阳性率约 70%-80%，可通过流式细胞术验证细胞身份；二是表达 NK 细胞杀伤相关受体，如 NKG2D（识别肿瘤细胞表面应激诱导分子）、KIR2DL（杀伤抑制受体，调控杀伤活性平衡），这些受体是其识别并杀伤肿瘤细胞的关键分子。
功能上，NK-92 细胞具备强大的肿瘤杀伤与免疫调节功能：一是高效的肿瘤杀伤活性，对多种肿瘤细胞系（如 K562 白血病细胞、A549 肺癌细胞）均有显著杀伤作用，杀伤率可达 50%-80%（通过乳酸脱氢酶释放法或流式细胞术检测），且无需抗原预先激活；二是丰富的细胞因子分泌功能，活化后可大量分泌 IFN-γ、TNF-α 等促炎细胞因子（分泌量较静息状态升高 15-20 倍），同时分泌 GM-CSF 等调节因子，参与免疫微环境调控；三是 ADCC 效应，在特异性抗体存在时，可通过 CD16 识别抗体 Fc 段，增强对肿瘤细胞的杀伤效率，进一步拓展其抗肿瘤应用场景。
二、体外培养与操作规范
（一）基础培养体系配置
NK-92 细胞对培养条件要求较高，需精准控制营养成分与环境参数以维持其杀伤功能：
培养基选择：优先使用α-MEM 培养基（含必需氨基酸与维生素），并添加 10% 胎牛血清、10% 马血清（双血清体系可更好支持 NK 细胞增殖与功能），若仅使用单一血清，细胞杀伤活性会下降 40% 以上；
添加剂：需加入 500U/mL IL-2（维持 NK 细胞活化状态与增殖，缺失 IL-2 会导致细胞在 3-5 天内大量凋亡），同时加入 1% 抗菌试剂预防污染；
培养环境：温度 37℃±0.5℃，CO₂浓度 5%±0.2%，湿度 95%±2%，pH 稳定在 7.2-7.4，渗透压 280-320mOsm/kg；使用透气盖培养瓶或摇瓶培养（转速 30-50rpm），确保气体充分交换，避免细胞因缺氧导致活性下降。
（二）传代与功能维持操作
传代时机：当细胞密度达到 1.5×10⁶-2×10⁶ cells/mL 时需及时传代（通常每 24-36 小时一次），避免密度过高引发凋亡。传代比例按 1:2-1:3 稀释，稀释时需确保新培养基中 IL-2 浓度维持在 500U/mL，避免因细胞因子不足影响功能。
传代步骤：
轻柔颠倒培养瓶 5-8 次，使细胞均匀悬浮（避免细胞沉淀导致取样不均）；
吸取定量细胞悬液加入含新鲜培养基（预加 IL-2）的培养瓶，用移液器缓慢吹打 3-4 次（力度适中，避免产生气泡破坏细胞膜）；
补充培养基至适宜体积，直接放入培养箱，无需其他处理，操作简便高效。
功能维持要点：长期传代易导致杀伤活性下降，需每 5-8 代检测一次肿瘤杀伤率（确保对 K562 细胞杀伤率≥50%）；若杀伤率下降，可在培养基中添加 10ng/mL IL-15（与 IL-2 协同增强活化信号）培养 24 小时，促进功能恢复；同时避免频繁更换血清批次，每次更换后需适应培养 2-3 代，待细胞活性稳定后再用于实验。
（三）冻存与复苏要点
冻存准备：选择对数生长期、杀伤活性正常的细胞（活力≥90%，杀伤率≥50%），冻存液按 “10% DMSO+40% 胎牛血清 + 40%α-MEM 培养基 + 10% 马血清 + 500U/mL IL-2" 配制，全程在冰浴中操作，DMSO 缓慢滴加并轻柔混匀，防止温度骤降损伤细胞。
冻存流程：离心收集细胞（800×g，5 分钟），弃上清后用预冷冻存液重悬，调整浓度为 1×10⁷-2×10⁷ cells/mL，分装至冻存管；采用程序降温法：4℃放置 30 分钟→-20℃放置 1 小时→-80℃放置 12 小时→转入液氮长期保存。
复苏操作：从液氮取出冻存管后，立即放入 37℃水浴快速解冻（40-60 秒内融化），避免 DMSO 长时间接触细胞产生毒性；将细胞悬液缓慢加入 10 倍体积预热的新鲜培养基（含 500U/mL IL-2），轻轻混匀后离心（800×g，5 分钟）去除 DMSO，用新鲜培养基重悬后接种至培养瓶。复苏 12 小时内可见少量细胞碎片，无需处理；24 小时后细胞可恢复正常增殖，若碎片比例超过 15%，需离心更换培养基并补充 1000U/mL IL-2，促进细胞恢复。
三、主要研究应用场景
（一）肿瘤免疫机制研究
NK-92 细胞是解析 NK 细胞抗肿瘤机制的核心工具：
杀伤机制研究：通过阻断实验（如用抗体阻断 NKG2D、CD16 受体），观察细胞对肿瘤细胞的杀伤率变化，明确不同受体在杀伤过程中的作用；例如，阻断 NKG2D 后，对 K562 细胞的杀伤率下降 60% 以上，验证该受体是 NK-92 细胞识别肿瘤的关键分子；
免疫逃逸研究：将 NK-92 细胞与耐药肿瘤细胞共培养，检测肿瘤细胞表面 MHCⅠ 类分子、PD-L1 等分子的表达变化，研究肿瘤细胞逃避 NK 细胞杀伤的机制，为逆转肿瘤免疫逃逸提供实验依据。
（二）抗肿瘤药物筛选与评估
依托其强大的肿瘤杀伤活性，NK-92 细胞可用于抗肿瘤药物研发：
免疫增强药物筛选：将候选免疫增强药物（如免疫检查点抑制剂、小分子免疫激活剂）与 NK-92 细胞共培养，检测细胞杀伤率、IFN-γ 分泌量，筛选能增强 NK 细胞活性的药物；例如，药物处理后若杀伤率提升 30% 以上且 IFN-γ 分泌增加 5 倍以上，提示该药物具有潜在免疫增强作用；
联合治疗评估：将 NK-92 细胞与hua疗药物、放疗联合使用，检测对肿瘤细胞的杀伤效果，评估联合治疗的协同作用；例如，NK-92 细胞与低剂量hua疗药物联合，对耐药肿瘤细胞的杀伤率较单独治疗提升 40%-50%，为临床联合治疗方案制定提供数据支持。
（三）过继免yi治疗相关研究
NK-92 细胞是过继免yi治疗技术研发的重要模型：
细胞改造研究：通过基因编辑技术（如 CAR-T 技术改造，表达肿瘤特异性 CAR 受体），增强 NK-92 细胞对特定肿瘤的靶向杀伤能力；例如，表达 CD19-CAR 的 NK-92 细胞，对 CD19 阳性淋巴瘤细胞的杀伤率可达 90% 以上，且安全性高于传统 CAR-T 细胞；
治疗安全性评估：将改造后的 NK-92 细胞与正常细胞共培养，检测对正常细胞的毒性、细胞因子释放水平，评估细胞治疗的安全性；同时在动物肿瘤模型中测试细胞的体内定植能力与抗肿瘤效果，为临床过继免yi治疗方案优化提供关键数据。
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