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P3X63Ag8小鼠骨髓瘤细胞
P3X63Ag8小鼠骨髓瘤细胞是源自 BALB/c 小鼠骨髓瘤的悬浮生长细胞系，核心特性是缺乏次黄piao呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT），且具备与 B 淋巴细胞高效融合形成杂交瘤的能力。该细胞系是单克隆抗体制备（杂交瘤技术）的经典工具细胞，可通过融合 B 细胞稳定分泌特异性单克隆抗体，同时在免疫机制研究、抗体药物研发中发挥关键作用，广泛应用于免疫学、药理学及医学诊断领域。
一、核心生物学特性
（一）来源与细胞本质
P3X63Ag8 细胞源自 BALB/c 小鼠的自发性骨髓瘤，经体外筛选与克隆纯化建立。作为浆细胞瘤衍生细胞系，其保留骨髓瘤细胞的恶性增殖特征，但因 HGPRT 基因缺陷，无法在次黄piao呤 - 氨基蝶呤 - 胸腺嘧啶（HAT）培养基中自主合成嘌呤与嘧啶，而融合后的杂交瘤细胞可借助 B 细胞的 HGPRT 基因在 HAT 培养基中存活，这一特性是杂交瘤筛选的关键依据，确保仅融合细胞能稳定增殖。
（二）形态与增殖特征
体外培养时，P3X63Ag8 细胞呈典型悬浮生长状态，细胞形态为圆形或椭圆形，大小均一（直径约 10-15μm），无明显贴壁能力（少量细胞可能因培养条件波动短暂贴壁，但无增殖能力）；胞质丰富，含细小颗粒，细胞核大而圆，位于细胞中央，核仁明显（1-2 个），染色质呈疏松状，分裂象多见（符合恶性浆细胞的增殖特征）。
增殖能力旺盛，倍增时间约 18-24 小时，传代 60 代以内可维持稳定增殖活性；细胞密度维持在 1×10⁵-1×10⁶ cells/mL 时增殖状态最佳，密度过高（>2×10⁶ cells/mL）易出现细胞凋亡（因营养缺乏与代谢废物积累），密度过低（<5×10⁴ cells/mL）会导致增殖速率下降，需及时调整细胞密度以维持活性。
（三）分子表型与功能特征
P3X63Ag8 细胞的分子与功能特征高度适配杂交瘤技术需求：
基因缺陷特性：HGPRT 基因缺陷是核心标志，可通过 HAT 培养基筛选验证（细胞在 HAT 中培养 3-5 天即出现大量凋亡，而杂交瘤细胞可正常生长）；
免疫相关分子：不表达功能性 B 细胞受体（BCR），也不自主分泌抗体（避免干扰融合后单克隆抗体的特异性检测），但表达 MHCⅡ 类分子与共刺激分子（如 CD40），可支持与 B 细胞的融合过程；
融合兼容性：与免疫后小鼠的脾脏 B 细胞融合效率高达 10⁻⁴-10⁻³，融合后的杂交瘤细胞既能保留 B 细胞的抗体分泌能力，又能继承骨髓瘤细胞的无限增殖特性，可长期稳定分泌特异性单克隆抗体。
二、体外培养与操作流程
（一）基础培养体系
P3X63Ag8 细胞对培养条件要求明确，需采用支持悬浮细胞生长的体系：
培养基选择：常规使用RPMI-1640 培养基（含 25mM HEPES 缓冲液、1mM 丙酮酸钠），添加 10%-15% 胎牛血清（需筛选低内毒素、批次稳定的血清，血清质量直接影响细胞融合效率与增殖活性）及 1% 抗菌试剂（预防细菌污染）；
培养环境：温度 37℃、5% CO₂、湿度 95%，CO₂浓度波动不超过 ±0.5%，pH 维持在 7.2-7.4，渗透压 280-320mOsm/kg；需使用带螺旋盖的培养瓶（或透气盖），培养时将瓶盖拧松 1/4 圈，确保气体交换，避免细胞缺氧导致凋亡。
（二）传代与密度控制
传代时机：当细胞密度达 8×10⁵-1×10⁶ cells/mL 时需及时传代（通常每 24-36 小时传代一次），避免密度过高引发凋亡；传代比例根据需求调整，常规实验按 1:5-1:10 稀释（如取 2mL 细胞悬液加入 8-18mL 新鲜培养基），大规模培养可按 1:3 稀释以快速扩增细胞。
传代步骤：
轻轻摇晃培养瓶，使悬浮细胞均匀分布（避免细胞沉淀导致取样不均）；
取适量细胞悬液加入新鲜培养基中，轻轻吹打 2-3 次（避免产生大量气泡，气泡会导致细胞破裂）；
将稀释后的细胞悬液转移至新培养瓶，置于培养箱中继续培养；无需消化处理（悬浮细胞无需解离，直接稀释即可）。
密度监测：每日通过细胞计数板计数细胞密度，同时用台盼蓝染色检测细胞活力（活力需维持在 90% 以上，低于 80% 需更换早期传代细胞），确保细胞处于最佳增殖状态。
（三）冻存与复苏要点
冻存细胞需选择对数生长期、活力≥95% 的细胞，确保复苏后活性稳定：
冻存液配置：含 10% 二甲基亚砜（DMSO）、20% 胎牛血清、70% RPMI-1640 培养基，现配现用（DMSO 需缓慢滴加，边加边轻轻摇晃，避免温度骤降损伤细胞）；
冻存步骤：离心收集细胞（1000×g，5 分钟），弃去上清，用冻存液重悬细胞，调整浓度为 5×10⁶-1×10⁷ cells/mL，分装至冻存管；采用梯度降温法冻存：4℃放置 30 分钟→-20℃放置 1 小时→-80℃放置过夜→转入液氮长期保存；
复苏步骤：从液氮取出冻存管，立即放入 37℃水浴中快速解冻（1 分钟内wan全融化，避免 DMSO 长时间接触细胞产生毒性）；将解冻后的细胞悬液缓慢加入 10 倍体积预热的新鲜培养基中，轻轻混匀，离心（1000×g，5 分钟）去除 DMSO，用新鲜培养基重悬后接种至培养瓶。
复苏存活率通常可达 85% 以上，复苏后 24 小时观察细胞状态，若出现大量细胞碎片（凋亡细胞），需离心更换培养基，培养 48 小时后细胞可恢复正常增殖速率。
三、主要研究应用场景
（一）单克隆抗体制备（杂交瘤技术核心应用）
P3X63Ag8 细胞是杂交瘤技术中zui常用的骨髓瘤融合伴侣，具体应用流程如下：
免疫小鼠：用目标抗原（如蛋白质、多肽、病毒颗粒）免疫 BALB/c 小鼠，每隔 2-3 周免疫一次，共免疫 3-4 次，末次免疫后 3 天取脾脏；
细胞融合：将脾脏研磨获得的 B 淋巴细胞与对数生长期的 P3X63Ag8 细胞按 5:1-10:1 比例混合，加入聚乙二醇（PEG，分子量 1500）诱导融合，融合时间控制在 1-2 分钟；
筛选培养：融合后将细胞悬液接种至 96 孔板，用 HAT 培养基培养（仅杂交瘤细胞可存活，未融合的 B 细胞 1-2 周内死亡，未融合的 P3X63Ag8 细胞因 HGPRT 缺陷 3-5 天死亡）；
抗体检测与克隆化：培养 2-3 周后，通过 ELISA、Western blot 等方法检测孔内上清液中的特异性抗体，筛选阳性孔；对阳性孔采用有限稀释法进行克隆化（将细胞稀释至 0.5-1 个细胞 / 孔），重复 2-3 次，获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
（二）免疫机制研究
依托 P3X63Ag8 细胞的免疫相关特性，可开展 B 细胞功能与免疫调节机制研究：
B 细胞活化信号研究：将 P3X63Ag8 细胞与 B 细胞共培养，添加不同免疫刺激剂（如 LPS、抗 CD40 抗体），检测细胞因子（如 IL-6、IL-10）的分泌变化，研究 B 细胞活化的信号通路（如 NF-κB、MAPK 通路）；
抗体分泌调控：通过基因干扰（如 siRNA 敲除 B 细胞中的 Blimp-1 基因，该基因调控抗体分泌）或药物抑制，观察杂交瘤细胞的抗体分泌量变化，解析抗体产生的调控机制；
免疫耐受研究：用自身抗原免疫小鼠后，将其 B 细胞与 P3X63Ag8 细胞融合，筛选不分泌自身抗体的杂交瘤细胞，研究免疫耐受的形成机制，为自身免疫病研究提供模型。
（三）抗体药物研发与评估
P3X63Ag8 细胞支持的杂交瘤技术是抗体药物研发的关键环节：
治疗性抗体筛选：针对肿瘤抗原（如 HER2、PD-L1）等靶点，利用 P3X63Ag8 细胞融合技术制备特异性单克隆抗体，通过体外细胞实验（如肿瘤细胞杀伤实验、病毒中和实验）评估抗体活性，筛选候选治疗性抗体；
抗体人源化前期研究：对筛选获得的鼠源单克隆抗体进行序列分析，构建人 - 鼠嵌合抗体或人源化抗体，通过 P3X63Ag8 细胞与改造后 B 细胞的融合，验证人源化抗体的分泌稳定性与活性；
诊断抗体开发：制备针对疾病标志物（如肿瘤标志物 CA125、感染标志物 HBsAg）的单克隆抗体，用于构建 ELISA 试剂盒、免疫层析试纸条等诊断试剂，P3X63Ag8 细胞可提供稳定的抗体来源，确保诊断试剂的批间一致性。
（四）基因工程抗体构建
结合基因工程技术，P3X63Ag8 细胞可用于重组抗体的表达与筛选：
抗体库筛选：构建噬菌体抗体库或酵母抗体库后，将筛选获得的抗体基因转染至 P3X63Ag8 细胞，通过抗性筛选与抗体检测，获得高效表达重组抗体的细胞株；
双特异性抗体表达：将双特异性抗体基因（可同时结合两个不同抗原）导入 P3X63Ag8 细胞，优化培养条件以提高抗体表达量，通过流式细胞术、细胞毒性实验验证双特异性抗体的靶向结合与杀伤效果，为肿瘤相关治疗提供新型抗体药物。
四、实验应用注意事项
细胞纯度与污染防控：P3X63Ag8 细胞为悬浮生长，易受细菌、真菌及支原体污染，且污染后难以清除（悬浮细胞无法通过换液wan全去除污染物）；需每传代 3-5 次通过 PCR 法检测支原体，培养过程中若发现培养基浑浊、出现絮状沉淀或异常颜色（如变黄、变紫过快），需立即丢弃污染细胞，对培养环境进行彻di消毒（超净台紫外线照射 30 分钟，培养箱用含氯消毒剂擦拭）；严禁与贴壁细胞共用培养箱，避免交叉污染。
融合效率优化：杂交瘤融合实验中，P3X63Ag8 细胞的状态直接影响融合效率，需确保细胞处于对数生长期（活力≥95%），且在融合前 24 小时更换新鲜培养基；PEG 的浓度与作用时间需严格控制（常用 50% PEG，作用 1 分钟），浓度过高或作用时间过长会导致细胞大量死亡，过低则融合效率下降；融合后接种至 96 孔板时，细胞密度需适中（约 1×10⁴ cells / 孔），密度过高易出现多克隆混杂，过低则阳性率低。
HAT 培养基使用规范：HAT 培养基中的氨基蝶呤（A）对细胞毒性较强，需现配现用（氨基蝶呤易降解，配制后 4℃保存不超过 1 周）；筛选培养时，第 1-2 周需每日观察孔内细胞生长情况，若发现细胞生长缓慢，可适当提高血清浓度（至 20%）；筛选 2 周后，若阳性孔内细胞密度过低，可更换为 HT 培养基（去除氨基蝶呤，减少细胞毒性），促进细胞增殖。
细胞传代与冻存周期：P3X63Ag8 细胞长期传代（超过 60 代）可能出现 HGPRT 基因回复突变（概率极低，但仍需警惕），导致在 HAT 培养基中可存活，干扰杂交瘤筛选；需定期（每 10 代）验证细胞的 HAT 敏感性（将细胞接种至 HAT 培养基，观察 3-5 天，确认细胞凋亡）；长期保种需每 5-10 代冻存一次，冻存细胞需标注代次与冻存日期，实验优先使用传代 20-40 代的细胞，确保功能稳定。
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