P3X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞

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P3X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞源自 BALB/c 小鼠，悬浮生长，具 HGPRT 缺陷，可高效融合 B 细胞，是单克隆抗体制备、抗体研发的重要工具细胞。

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更新时间：2025-10-28

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P3X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞

P3X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞是 P3X63Ag8 细胞的克隆衍生株，源自 BALB/c 小鼠骨髓瘤，核心特性为缺乏次黄piao呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）且无免疫球蛋白重链与轻链基因表达，具备与 B 淋巴细胞高效融合形成杂交瘤的能力。作为单克隆抗体制备的优质工具细胞，其融合效率与抗体分泌稳定性更优，广泛应用于免疫学研究、抗体药物研发及医学诊断领域。

一、核心生物学特性

（一）来源与细胞本质

P3X63-Ag8.653 细胞由 P3X63Ag8 细胞经克隆筛选获得，保留骨髓瘤细胞的恶性增殖特征，同时通过基因筛选剔除免疫球蛋白编码基因。因 HGPRT 基因缺陷，无法在次黄piao呤 - 氨基蝶呤 - 胸腺嘧啶（HAT）培养基中自主合成嘌呤与嘧啶，仅能依赖融合的 B 细胞提供 HGPRT 基因存活，这一特性为杂交瘤细胞的特异性筛选提供关键依据，有效避免未融合细胞干扰。

（二）形态与增殖特征

体外培养时呈典型悬浮生长状态，细胞形态为圆形或椭圆形，大小均一（直径约 12-16μm），无贴壁能力（仅少数细胞因培养条件波动短暂附着瓶壁，无增殖活性）；胞质透明，含少量细小颗粒，细胞核大而圆，位于细胞中央，核仁清晰（1-2 个），染色质呈疏松网状，分裂象频繁（符合恶性浆细胞增殖特征）。

增殖能力强劲，倍增时间约 16-22 小时，传代 80 代以内可维持稳定增殖活性；细胞密度在 1×10⁵-1.5×10⁶ cells/mL 时增殖状态最佳，密度超过 2.5×10⁶ cells/mL 易因营养竞争引发凋亡，密度低于 5×10⁴ cells/mL 会导致增殖停滞，需通过定期传代维持最佳密度范围。

（三）分子表型与功能特征

P3X63-Ag8.653 细胞的分子特性高度适配杂交瘤技术需求，较亲本株优势显著：

基因缺陷特性：HGPRT 基因缺陷稳定，同时缺失免疫球蛋白重链（IgH）与轻链（IgL）基因，不自主分泌抗体，彻di避免融合后杂交瘤抗体的杂带干扰，简化抗体检测流程；

免疫相关分子：表达 MHCⅡ 类分子（如 I-Ab）、共刺激分子 CD40 及黏附分子 ICAM-1，增强与 B 细胞的相互作用，融合效率较亲本株提升 30%-50%，可达 10⁻³-10⁻²；

代谢适应性：对 HAT 培养基敏感性更高，未融合细胞在 HAT 中 2-3 天即可wan全凋亡，缩短杂交瘤筛选周期，减少阴性孔对实验资源的占用。

二、体外培养与操作流程

（一）基础培养体系

P3X63-Ag8.653 细胞对培养条件要求精准，需采用优化的悬浮细胞培养体系：

培养基选择：优先使用RPMI-1640 培养基（含 25mM HEPES 缓冲液、1mM 丙酮酸钠、0.1mM 非必需氨基酸），添加 12%-15% 胎牛血清（需通过预实验筛选支持高融合效率的批次，血清白蛋白含量需≥35g/L）及 1% 抗菌试剂（预防细菌污染）；

培养环境：温度 37℃±0.5℃、5% CO₂±0.2%、湿度 95%±2%，pH 维持在 7.2-7.4，渗透压 290-310mOsm/kg；使用透气盖培养瓶，确保气体充分交换，避免细胞因缺氧出现形态异常（如胞质颗粒增多、细胞核固缩）。

（二）传代与密度控制

传代时机：当细胞密度达 1×10⁶-1.2×10⁶ cells/mL 时需及时传代（通常每 18-24 小时传代一次），避免密度过高引发细胞凋亡；传代比例根据实验需求调整，常规实验按 1:6-1:12 稀释（如取 1mL 细胞悬液加入 5-11mL 新鲜培养基），大规模融合实验前按 1:3 稀释以快速扩增细胞。

传代步骤：

轻柔颠倒培养瓶 5-8 次，使悬浮细胞均匀分布（避免细胞沉淀导致取样偏差）；

取定量细胞悬液加入新鲜培养基，用移液器缓慢吹打 3-4 次（避免产生气泡，气泡会破坏细胞膜完整性）；

将稀释后的细胞悬液转移至新培养瓶，置于培养箱中培养；无需消化处理，直接稀释即可维持细胞活性。

密度监测：每日采用台盼蓝染色法计数细胞密度与活力，活力需维持在 95% 以上，低于 90% 需更换早期传代细胞（如第 10-20 代冻存细胞），确保细胞处于最佳功能状态。

（三）冻存与复苏要点

冻存细胞需选择对数生长期、活力≥98% 的细胞，确保复苏后功能稳定：

冻存液配置：含 10% 二甲基亚砜（DMSO，细胞级，纯度≥99.5%）、20% 胎牛血清、70% RPMI-1640 培养基，配置过程需在冰浴中进行，DMSO 缓慢滴加并不断轻柔混匀，避免温度骤降损伤细胞；

冻存步骤：离心收集细胞（1000×g，5 分钟），弃去上清，用预冷的冻存液重悬细胞，调整浓度为 8×10⁶-1×10⁷ cells/mL，分装至冻存管；采用程序降温法冻存：4℃放置 30 分钟→-20℃放置 1 小时→-80℃放置 12 小时→转入液氮长期保存；

复苏步骤：从液氮取出冻存管，立即放入 37℃水浴中快速解冻（40-60 秒内wan全融化），避免 DMSO 长时间接触细胞产生毒性；将解冻后的细胞悬液缓慢加入 10 倍体积预热的新鲜培养基，轻轻混匀，离心（1000×g，5 分钟）去除 DMSO，用新鲜培养基重悬后接种至培养瓶。

复苏存活率可达 90% 以上，复苏后 12 小时观察细胞状态，若出现少量细胞碎片，无需特殊处理，24 小时后细胞可恢复正常增殖；若碎片比例超过 10%，需离心更换培养基，补充 2% 额外血清促进细胞恢复。

三、主要研究应用场景

（一）高特异性单克隆抗体制备

P3X63-Ag8.653 细胞是杂交瘤技术的优选融合伴侣，尤其适用于高特异性抗体制备：

免疫与细胞制备：用高纯度目标抗原（如重组蛋白、小分子化合物偶联载体）免疫 BALB/c 小鼠，末次免疫后 3 天取脾脏，研磨获得单细胞悬液，通过淋巴细胞分离液纯化 B 细胞；

细胞融合：将纯化的 B 细胞与对数生长期的 P3X63-Ag8.653 细胞按 8:1-12:1 比例混合，加入 50% 聚乙二醇（PEG，分子量 1500）诱导融合，融合时间控制在 90-120 秒，降低细胞毒性；

筛选与克隆：融合后将细胞悬液接种至 96 孔板，用 HAT 培养基培养，5-7 天更换一次培养基，10-14 天通过 ELISA、Western blot 筛选特异性抗体阳性孔；对阳性孔采用有限稀释法克隆化 3 次，获得单克隆杂交瘤细胞株，可稳定分泌抗体 6 个月以上。

（二）抗体工程与改造研究

依托其无内源性抗体表达的特性，可用于基因工程抗体的构建与筛选：

重组抗体表达：将噬菌体抗体库筛选获得的抗体基因（如 scFv、Fab 片段）克隆至真核表达载体，转染 P3X63-Ag8.653 细胞，通过抗性筛选与抗体检测，获得高效表达重组抗体的细胞株，表达量可达 5-10μg/mL/ 天；

双特异性抗体开发：构建双特异性抗体基因（如 CD3×HER2 双抗），转染 P3X63-Ag8.653 细胞，优化培养条件（如添加 1mM 丁酸钠）提升抗体表达量，通过流式细胞术验证双抗的双靶点结合能力，为肿瘤免yi治疗提供候选药物。

（三）免疫机制与信号通路研究

利用其免疫相关分子表达特性，可开展 B 细胞活化与抗体分泌机制研究：

B 细胞共刺激信号研究：将 P3X63-Ag8.653 细胞与 B 细胞共培养，添加不同共刺激分子抗体（如抗 CD40L、抗 CD86），检测细胞因子（IL-6、IL-10）分泌与 B 细胞增殖情况，解析共刺激信号对 B 细胞活化的调控作用；

抗体分泌调控机制：通过 CRISPR/Cas9 技术敲除杂交瘤细胞中的 Blimp-1、XBP-1 等抗体分泌相关基因，观察抗体产量变化，结合 RNA 测序分析差异表达基因，阐明抗体分泌的分子调控网络。

（四）诊断试剂与药物研发

在医学诊断与抗体药物研发中发挥关键作用：

诊断抗体制备：针对传染病标志物（如 HBsAg、HCV E2 蛋白）、肿瘤标志物（如 CEA、CA19-9）制备单克隆抗体，用于构建 ELISA 试剂盒、免疫层析试纸条，因无内源性抗体干扰，诊断灵敏度较传统杂交瘤技术提升 20%-30%；

治疗性抗体评估：将候选治疗性抗体（如抗 PD-L1 抗体）与 P3X63-Ag8.653 细胞构建的杂交瘤细胞共培养，通过细胞毒性实验、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）检测，评估抗体的生物学活性，为临床前研究提供数据支持。

四、实验应用注意事项

污染防控与细胞纯度：细胞为悬浮生长，易受支原体、病毒污染，需每传代 2-3 次通过 PCR 法检测支原体，每季度检测病毒（如小鼠微小病毒、仙台病毒）；培养过程中若发现培养基出现异常浑浊、颜色变化（如呈橘红色、黑色），需立即丢弃污染细胞，对培养环境用 75% 乙醇擦拭并紫外线照射 60 分钟，避免交叉污染；严禁与其他悬浮细胞（如淋巴细胞）共用培养试剂，确保细胞纯度。

融合实验优化：融合前 24 小时需更换 P3X63-Ag8.653 细胞的新鲜培养基，提升细胞活力；PEG 需在 37℃水浴中预热至与细胞温度一致，避免温度差异导致细胞损伤；融合后接种 96 孔板时，细胞密度需控制在 2×10³-5×10³ cells / 孔，密度过高易出现多克隆混杂，过低则阳性率降低；HAT 培养基需在融合后 24 小时内更换一次，去除未融合细胞碎片，减少毒性物质积累。

培养基与血清选择：培养基需添加非必需氨基酸与丙酮酸钠，满足细胞高代谢需求，缺乏这些成分会导致细胞增殖速率下降 30%-50%；血清需通过预实验筛选，选择支持高融合效率的批次，可通过对比不同血清批次的细胞融合率（需≥5×10⁻³）与杂交瘤克隆形成数确定最佳血清；血清解冻后需分装保存，避免反复冻融破坏生长因子活性。

细胞传代与保种策略：长期传代（超过 60 代）可能导致细胞 HGPRT 缺陷稳定性下降，需每 10 代验证细胞的 HAT 敏感性（接种 HAT 培养基 3 天，细胞凋亡率需≥99%）；长期保种需采用 “梯度传代冻存法"，即每 5 代冻存一次，每次冻存 3-5 支，标注代次、冻存日期与操作人员；实验优先使用传代 20-50 代的细胞，确保融合效率与抗体分泌稳定性。

上一个：EGFR ELISA试剂盒