P3X63Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞

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P3X63Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞，源自 BALB/c 小鼠，悬浮生长，缺 HGPRT 且无内源性抗体表达，融合效率高，是单克隆抗体制备、抗体研发的优质工具。

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更新时间：2025-10-28

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P3X63Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞

P3X63Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞是 P3X63Ag8 细胞的克隆衍生株，源于 BALB/c 小鼠骨髓瘤组织，凭借 “缺乏次黄piao呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）+ 无内源性抗体表达" 的双重核心特性，成为单克隆抗体制备、抗体工程研发的关键工具细胞。其融合效率与抗体分泌稳定性显著优于亲本株，在免疫学研究、医学诊断试剂开发及治疗性抗体评估中应用广泛。

一、核心生物学特性

（一）细胞来源与本质

该细胞由 P3X63Ag8 细胞经多轮克隆筛选获得，保留骨髓瘤细胞的恶性增殖能力，同时通过基因筛选敲除免疫球蛋白重链（IgH）与轻链（IgL）编码基因。因 HGPRT 基因缺陷，无法在次黄piao呤 - 氨基蝶呤 - 胸腺嘧啶（HAT）培养基中合成嘌呤与嘧啶，仅能依赖融合的 B 细胞提供 HGPRT 基因存活，这一特性为杂交瘤细胞的特异性筛选提供精准依据，彻di排除未融合细胞对实验结果的干扰。

（二）形态与增殖表现

体外培养时呈纯悬浮生长状态，无贴壁倾向（偶有少量细胞短暂附着瓶壁，无增殖活性），细胞形态为规则圆形或椭圆形，大小均一（直径 12-16μm）；胞质透明洁净，含少量细小颗粒，细胞核居中且圆润，核仁清晰可见（1-2 个），染色质呈疏松网状，分裂象频繁，典型符合恶性浆细胞的形态特征。

增殖能力突出，倍增时间仅 16-22 小时，传代 80 代内可维持稳定增殖状态。细胞密度需严格控制在 1×10⁵-1.5×10⁶ cells/mL：密度超过 2.5×10⁶ cells/mL 时，易因营养竞争、代谢废物堆积引发大规模凋亡；密度低于 5×10⁴ cells/mL 时，增殖会陷入停滞，需通过规律传代维持最佳密度区间。

（三）分子与功能优势

相较于亲本株，该细胞的分子特性更适配杂交瘤技术需求：

基因缺陷稳定：HGPRT 缺陷状态长期保持，且无内源性抗体分泌，避免融合后杂交瘤抗体检测出现杂带，大幅简化后续筛选流程；

融合适配性强：表面高表达 MHCⅡ 类分子（I-Ab）、共刺激分子 CD40 及黏附分子 ICAM-1，能增强与 B 细胞的相互作用，融合效率较亲本株提升 30%-50%，可达 10⁻³-10⁻²；

代谢敏感性高：对 HAT 培养基的敏感性显著高于普通骨髓瘤细胞，未融合细胞在 HAT 培养基中 2-3 天即可wan全凋亡，将杂交瘤筛选周期缩短至 10-14 天，减少实验资源浪费。

二、体外培养与操作规范

（一）基础培养体系配置

该细胞对培养条件要求较高，需采用优化的悬浮细胞培养方案：

培养基选择：优先使用含 25mM HEPES 缓冲液、1mM 丙酮酸钠、0.1mM 非必需氨基酸的RPMI-1640 培养基，三者协同满足细胞高代谢需求 —— 缺乏非必需氨基酸会导致增殖速率下降 30%-50%，缺失丙酮酸钠则会影响细胞能量供应；

血清添加：需添加 12%-15% 胎牛血清（需通过预实验筛选批次，要求白蛋白含量≥35g/L，且支持杂交瘤克隆形成率≥5×10⁻³），同时加入 1% 抗菌试剂预防细菌污染；

培养环境：温度控制在 37℃±0.5℃，CO₂浓度维持 5%±0.2%，湿度保持 95%±2%，pH 稳定在 7.2-7.4，渗透压 290-310mOsm/kg；建议使用透气盖培养瓶，确保气体充分交换，避免细胞因缺氧出现胞质颗粒增多、细胞核固缩等异常形态。

（二）传代与密度监测

传代时机：当细胞密度达到 1×10⁶-1.2×10⁶ cells/mL 时需立即传代（通常每 18-24 小时一次），避免密度过高引发凋亡；传代比例根据实验需求调整 —— 常规培养按 1:6-1:12 稀释，大规模融合实验前按 1:3 稀释以快速扩增细胞。

传代步骤：

轻柔颠倒培养瓶 5-8 次，使细胞均匀悬浮（避免细胞沉淀导致取样不均，影响传代后增殖一致性）；

吸取定量细胞悬液加入新鲜培养基，用移液器缓慢吹打 3-4 次（力度适中，避免产生气泡破坏细胞膜）；

将稀释后的细胞悬液转移至新培养瓶，直接放入培养箱即可（悬浮细胞无需消化，简化操作流程）。

密度监测：每日用台盼蓝染色法计数，要求细胞活力维持在 95% 以上；若活力低于 90%，需立即更换早期传代冻存细胞（如第 10-20 代细胞），确保后续实验中细胞功能稳定。

（三）冻存与复苏操作

冻存准备：选择对数生长期、活力≥98% 的细胞，确保复苏后活性；冻存液按 “10% DMSO+20% 胎牛血清 + 70% RPMI-1640 培养基" 配制，全程冰浴操作，DMSO 缓慢滴加并不断轻柔混匀，防止温度骤降损伤细胞。

冻存流程：离心收集细胞（1000×g，5 分钟），弃上清后用预冷冻存液重悬，调整浓度为 8×10⁶-1×10⁷ cells/mL，分装至冻存管；采用程序降温法：4℃静置 30 分钟→-20℃放置 1 小时→-80℃冷藏 12 小时→转入液氮长期保存（液氮温度需稳定在 - 196℃以下）。

复苏操作：从液氮取出冻存管后，立即放入 37℃水浴快速解冻（40-60 秒内wan全融化，避免 DMSO 长时间接触细胞产生毒性）；将细胞悬液缓慢加入 10 倍体积预热的新鲜培养基，轻轻混匀后离心（1000×g，5 分钟）去除 DMSO，用新鲜培养基重悬后接种至培养瓶。

复苏后观察：复苏 12 小时内可见少量细胞碎片，无需处理；24 小时后细胞可恢复正常增殖；若碎片比例超过 10%，需离心更换培养基并补充 2% 额外血清，促进细胞恢复。

三、主要研究应用场景

（一）高特异性单克隆抗体制备

作为杂交瘤技术的优选融合伴侣，该细胞能高效制备高特异性单克隆抗体：

免疫与细胞制备：用高纯度目标抗原（如重组蛋白、小分子化合物 - 载体偶联物）免疫 BALB/c 小鼠，末次免疫后 3 天取脾脏，研磨成单细胞悬液，通过淋巴细胞分离液纯化 B 细胞（提高融合效率）；

细胞融合：将纯化 B 细胞与对数生长期的 P3X63Ag8.653 细胞按 8:1-12:1 比例混合，加入 50% 聚乙二醇（PEG，分子量 1500）诱导融合，融合时间严格控制在 90-120 秒（减少细胞毒性）；

筛选与克隆：融合后细胞接种至 96 孔板，用 HAT 培养基培养，5-7 天更换一次培养基；10-14 天后通过 ELISA、Western blot 筛选特异性抗体阳性孔，对阳性孔采用有限稀释法克隆化 3 次，最终获得可稳定分泌抗体 6 个月以上的单克隆杂交瘤细胞株。

（二）抗体工程与改造

依托无内源性抗体表达的特性，该细胞是基因工程抗体构建的理想载体：

重组抗体表达：将噬菌体抗体库筛选获得的抗体基因（如 scFv、Fab 片段）克隆至真核表达载体，转染 P3X63Ag8.653 细胞，通过抗性筛选与抗体检测，获得表达量达 5-10μg/mL/ 天的重组抗体细胞株；

双特异性抗体开发：构建双靶点抗体基因（如 CD3×HER2 双抗），转染细胞后添加 1mM 丁酸钠优化培养条件，提升抗体表达量；通过流式细胞术验证双抗对两个靶点的结合能力，为肿瘤免yi治疗提供候选药物。

（三）诊断与治疗性抗体研发

在医学诊断与药物评估中发挥关键作用：

诊断试剂制备：针对传染病标志物（HBsAg、HCV E2 蛋白）、肿瘤标志物（CEA、CA19-9）制备单克隆抗体，用于构建 ELISA 试剂盒、免疫层析试纸条；因无内源性抗体干扰，诊断灵敏度较传统技术提升 20%-30%；

治疗性抗体评估：将候选治疗性抗体（如抗 PD-L1 抗体）与该细胞构建的杂交瘤细胞共培养，通过细胞毒性实验、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）检测，评估抗体的生物学活性，为临床前研究提供核心数据。

四、实验应用注意事项

污染防控：细胞为悬浮生长，易受支原体、病毒污染，需每传代 2-3 次用 PCR 法检测支原体，每季度检测小鼠微小病毒、仙台病毒；发现培养基浑浊、颜色异常（橘红色、黑色）时，立即丢弃污染细胞，用 75% 乙醇擦拭培养箱并紫外线照射 60 分钟；严禁与其他悬浮细胞共用培养基、移液器等试剂，确保细胞纯度。

融合实验优化：融合前 24 小时更换细胞新鲜培养基，提升细胞活力；PEG 需预热至 37℃（与细胞温度一致），避免温度差损伤细胞；融合后接种 96 孔板时，细胞密度控制在 2×10³-5×10³ cells / 孔，过高易出现多克隆混杂，过低则阳性率降低；24 小时内更换 HAT 培养基，去除未融合细胞碎片。

血清与传代管理：血清解冻后分装为 10-20mL / 支，避免反复冻融破坏生长因子；长期传代（超过 60 代）需每 10 代验证 HAT 敏感性（接种 HAT 培养基 3 天，细胞凋亡率≥99%）；采用 “梯度冻存法" 保种，每 5 代冻存 3-5 支，标注代次、日期与操作人员；实验优先使用传代 20-50 代的细胞，保障融合效率与抗体分泌稳定性。

上一个：A505Quidel C9 Depleted Sera（C9去除血清）