PA317小鼠胚胎成纤维细胞

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PA317小鼠胚胎成纤维细胞源自小鼠胚胎，贴壁生长，可高效包装逆转录病毒，适用于基因转导、基因治疗研究及重组病毒制备。

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更新时间：2025-10-28

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PA317小鼠胚胎成纤维细胞

PA317小鼠胚胎成纤维细胞是源自小鼠胚胎组织的贴壁生长细胞系，核心特性是具备高效包装逆转录病毒的能力，可作为病毒载体生产的工具细胞。该细胞兼具胚胎成纤维细胞的增殖稳定性与病毒包装细胞的功能特异性，能将外源目的基因通过逆转录病毒载体高效导入靶细胞，成为基因转导、基因功能研究及基因治疗相关实验的关键载体工具，广泛应用于分子生物学、细胞生物学及医学研究领域。

一、核心生物学特性

（一）来源与细胞本质

PA317 细胞源自 C57BL/6 小鼠的胚胎成纤维组织，经体外分离培养与筛选获得。与普通小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）相比，PA317 细胞经基因改造或天然筛选，稳定表达逆转录病毒包装所需的 gag、pol 基因（分别编码病毒核心蛋白与逆转录酶），但不表达 env 基因（编码病毒包膜蛋白），这种 “缺陷型" 特性使其可通过导入含 env 基因与目的基因的逆转录病毒载体，组装成具有感染能力但无自主复制能力的重组逆转录病毒，避免病毒在体内扩散导致的安全风险。

（二）形态与增殖特征

PA317 细胞在体外培养时呈典型成纤维细胞形态，细胞呈长梭形或不规则纺锤形，贴壁生长时呈放射状或漩涡状分布，细胞间连接紧密，单层生长不重叠（无明显堆积现象）；胞质透明，含少量颗粒，细胞核呈椭圆形，位于细胞中央，核仁清晰（1-2 个），染色质分布均匀，符合成纤维细胞的基础形态特征。

增殖能力稳定，倍增时间约 24-36 小时，传代 50 代以内可维持稳定的增殖活性与病毒包装能力；平板克隆形成率约 15%-25%，低于肿瘤细胞但高于普通原代 MEF（<10%），反映其体外培养的适应性与克隆形成能力，便于单克隆筛选与细胞纯化。

（三）病毒包装核心功能

PA317 细胞的核心价值在于高效包装逆转录病毒：

包装效率：当导入含目的基因的逆转录病毒载体（如 pLXSN、pBabe 系列载体）后，细胞可高效组装重组病毒颗粒，病毒滴度通常可达 10⁴-10⁵ CFU/mL（空斑形成单位 / 毫升），显著高于普通 MEF 细胞（<10³ CFU/mL），能满足大多数细胞的基因转导需求；

病毒安全性：因自身不表达 env 基因，需依赖载体提供的包膜蛋白（如 amphotropic 包膜蛋白，可感染多种哺乳动物细胞）组装病毒，且重组病毒仅含目的基因与病毒复制必需的顺式元件，无病毒复制所需的反式元件，故无法自主复制，仅能感染靶细胞一次并整合目的基因，安全性高；

宿主范围：包装的重组逆转录病毒因携带 amphotropic 包膜蛋白，可感染小鼠、大鼠、人、兔等多种哺乳动物的贴壁或悬浮细胞，宿主范围广，适用性强，无需针对不同物种细胞更换包装细胞。

（四）分子表型特征

分子层面，PA317 细胞具备支持病毒包装的关键分子特征：

病毒相关基因：稳定表达 gag 基因（编码 p24、p17 等核心蛋白）与 pol 基因（编码逆转录酶、整合酶），为病毒颗粒的组装与目的基因的逆转录、整合提供必要的酶与结构蛋白；

载体识别元件：细胞膜表面表达逆转录病毒载体的受体（如阳离子氨基酸转运体 CAT-1），可高效结合含 amphotropic 包膜蛋白的病毒载体，确保载体顺利进入细胞；

细胞因子表达：分泌少量成纤维细胞生长因子（FGF）、转化生长因子 -β（TGF-β），可维持自身贴壁生长状态，同时轻微促进周围细胞增殖，不影响病毒包装与目的基因表达。

二、体外培养与病毒包装流程

（一）基础培养体系

PA317 细胞对培养基要求明确，常规采用DMEM 高糖培养基（含 4.5g/L 葡萄糖、丙酮酸钠），添加 10% 胎牛血清（需选择无病毒污染、低内毒素的批次，避免影响病毒包装效率）及 1% 抗菌试剂（预防细菌污染）。

培养环境需严格控制：温度 37℃、5% CO₂、95% 湿度，CO₂浓度波动不超过 ±0.5%，pH 维持在 7.2-7.4，渗透压 280-320mOsm/kg；温度过低（<35℃）会导致细胞增殖缓慢、病毒包装效率下降，CO₂浓度过高会引发培养基酸化，影响细胞活性，需通过培养箱传感器实时监控环境参数。

（二）传代与纯化操作

传代时机需结合细胞状态与实验需求：当细胞汇合度达 70%-80% 时及时传代（若超过 90%，细胞易出现接触抑制，病毒包装能力下降），传代比例控制在 1:2-1:4（比例过高会导致细胞密度过低，贴壁慢；比例过低易快速汇合，影响后续病毒包装）。

传代步骤：

弃去旧培养基，用无菌 PBS 轻柔冲洗细胞表面 2 次，去除残留血清；

加入含 0.02% EDTA 的细胞解离液，37℃孵育 1-2 分钟，显微镜下观察到细胞边缘收缩、间隙增大（细胞变圆）即可终止；

加入 3-5 倍体积基础培养基，轻柔吹打制成单细胞悬液（吹打次数 8-12 次，避免剧烈吹打导致细胞损伤）；

按 1:2-1:4 比例接种至新培养瓶，补充新鲜培养基，培养 24 小时内细胞可wan全贴壁，恢复正常形态与增殖。

若需纯化细胞（如排除杂细胞污染），可采用有限稀释法进行单克隆培养，筛选形态均一、病毒包装效率稳定的单克隆细胞株，确保实验重复性。

（三）病毒包装与收集流程

利用 PA317 细胞包装重组逆转录病毒的标准流程：

细胞准备：将对数生长期的 PA317 细胞接种至 6 孔板，培养 24 小时，待细胞汇合度达 50%-60% 时进行转染（此时细胞转染效率zui高，病毒包装效果zuijia）；

载体转染：采用脂质体转染法（如 Lipofectamine 2000）将含目的基因的逆转录病毒载体（如 pLXSN-EGFP）与转染试剂混合，室温孵育 20 分钟后加入细胞培养孔，培养 6-8 小时后更换为新鲜培养基（含 2% 胎牛血清，减少血清对病毒的影响）；

病毒收集：转染后 48-72 小时收集细胞培养上清（此时病毒滴度最高），通过 0.45μm 滤膜过滤上清，去除细胞碎片，获得含重组病毒的上清液；

病毒浓缩与保存：若需提高病毒滴度，可将上清液通过超速离心（25000×g，4℃离心 2 小时）浓缩，用少量无血清培养基重悬病毒沉淀；病毒可短期（48 小时内）置于 4℃保存，长期需分装后 - 80℃保存，避免反复冻融导致滴度下降。

（四）冻存与复苏要点

冻存对象优先选择对数生长期、病毒包装效率稳定的细胞：

冻存液配置：含 10% 二甲基亚砜（DMSO）、20% 胎牛血清、70% DMEM 高糖培养基的混合液（高血清比例可减少冻存损伤，维持病毒包装相关基因的稳定表达）；

冻存步骤：离心收集细胞，调整浓度为 1×10⁶-2×10⁶ cells/mL，分装后梯度降温（4℃ 30 分钟→-20℃ 1 小时→-80℃过夜→液氮长期保存），避免直接冷冻导致细胞破裂；

复苏步骤：从液氮取出冻存管，快速放入 37℃水浴 1-2 分钟解冻，立即加入 10 倍体积预热的基础培养基稀释，1000×g 离心 5 分钟去除 DMSO，重悬后接种至培养瓶。

复苏存活率通常可达 85% 以上，复苏后需培养 2-3 代，待细胞形态、增殖速率稳定后，需通过小剂量病毒包装实验验证其包装效率（如检测病毒滴度是否维持在 10⁴ CFU/mL 以上），确保后续实验可靠性。

三、主要研究应用场景

（一）基因转导与功能研究

PA317 细胞包装的逆转录病毒是高效的基因转导工具，广泛用于细胞生物学研究：

目的基因过表达：将编码蛋白的目的基因（如致癌基因 MYC、抑癌基因 p53）构建至逆转录病毒载体，通过 PA317 细胞包装病毒后感染靶细胞（如 MEF、肿瘤细胞），实现目的基因的稳定过表达，研究基因对细胞增殖、凋亡、分化的调控作用；

RNA 干扰实验：将靶向特定基因的 shRNA（短发夹 RNA）插入病毒载体，包装病毒后感染靶细胞，实现基因的稳定敲低，通过观察细胞表型变化（如侵袭能力下降、耐药性消失），解析基因的功能，尤其适用于难以通过瞬时转染实现基因沉默的细胞（如原代细胞、悬浮细胞）；

报告基因表达：将荧光蛋白（如 EGFP、mCherry）或 luciferase（荧光素酶）等报告基因导入载体，包装病毒后感染靶细胞，通过荧光观察或化学发光检测，追踪细胞增殖、迁移轨迹或评估信号通路活性（如结合 luciferase 报告基因检测 NF-κB 通路活性）。

（二）基因治疗相关研究

PA317 细胞因病毒包装效率高、安全性好，是基因治疗前期研究的重要工具：

遗传病模型研究：在小鼠遗传病模型（如镰状细胞贫血、囊性纤维化）中，利用 PA317 细胞包装含正常基因的逆转录病毒，感染患者来源的造血干细胞或上皮细胞，观察正常基因的表达是否能纠正细胞的病理缺陷，为遗传病的基因治疗提供前期数据；

肿瘤基因治疗探索：将抗肿瘤相关基因（如zi杀基因 HSV-tk、细胞因子基因 IL-2）构建至病毒载体，通过 PA317 细胞包装病毒后感染肿瘤细胞，实现基因在肿瘤细胞中的特异性表达 —— 如 HSV-tk 基因表达后，可将前药更xi洛韦转化为毒性物质，特异性杀伤肿瘤细胞，为肿瘤基因治疗策略的优化提供体外与体内实验支持；

病毒载体优化：利用 PA317 细胞筛选高效的逆转录病毒载体元件（如启动子、增强子），通过比较不同载体的病毒滴度与目的基因表达效率，优化载体设计，提高基因治疗的有效性。

（三）病毒学基础研究

PA317 细胞可用于逆转录病毒的复制机制与抗病du药物筛选研究：

病毒组装机制：通过基因编辑（如 CRISPR/Cas9 敲除 gag 或 pol 基因）或药物抑制（如逆转录酶抑制剂 AZT），观察 PA317 细胞包装病毒的过程变化（如病毒颗粒组装受阻、病毒 RNA 整合异常），解析逆转录病毒的复制与组装机制；

抗病du药物筛选：将 PA317 细胞包装的重组病毒与候选抗病du药物共孵育，通过检测病毒滴度（如空斑实验）或目的基因表达效率（如荧光强度检测），筛选可抑制逆转录病毒复制的药物，为病毒性疾病的治疗提供新靶点；

病毒宿主相互作用：利用 PA317 细胞包装含不同包膜蛋白的逆转录病毒，感染不同物种的靶细胞，研究病毒包膜蛋白与宿主细胞受体的相互作用，明确病毒的宿主范围决定因素，为跨物种病毒传播的预防研究提供依据。

（四）细胞模型构建

PA317 细胞辅助的基因转导技术可用于构建稳定的细胞模型：

稳定细胞系构建：将耐药基因（如 neo 基因，抗 G418）与目的基因共导入病毒载体，通过 PA317 细胞包装病毒后感染靶细胞，经 G418 筛选获得稳定表达目的基因的细胞系（如稳定表达 EGFP 的 HeLa 细胞、稳定敲低 MMP-9 的 A549 细胞），避免瞬时转染的随机性，适用于长期实验（如细胞增殖曲线绘制、动物移植实验）；

诱导性细胞模型：将目的基因与诱导性启动子（如 tet-on 系统）构建至病毒载体，包装病毒后感染靶细胞，获得诱导性表达目的基因的细胞模型 —— 如在 DOX（强力mei素）诱导下表达致癌基因，模拟肿瘤发生过程，研究肿瘤形成的动态机制；

细胞分化模型：通过病毒转导将分化相关基因（如神经分化基因 NeuroD1、心肌分化基因 GATA4）导入多能干细胞或前体细胞，诱导细胞定向分化，结合 PA317 细胞的高效转导能力，提高分化效率与细胞纯度，构建体外分化模型用于发育生物学研究。

四、实验应用注意事项

细胞状态与病毒包装效率关联：PA317 细胞的病毒包装效率高度依赖细胞状态 —— 汇合度过高（>90%）、细胞老化（传代 > 50 代）或污染（如支原体、真菌）会导致包装效率显著下降（病毒滴度降低 50% 以上），因此实验前需通过显微镜观察细胞形态（确保无梭形化、空泡化），并通过小剂量转染实验验证包装效率，若效率下降需及时复苏早期冻存的细胞。

病毒操作安全规范：PA317 细胞包装的重组逆转录病毒虽无自主复制能力，但仍需遵循生物安全二级（BSL-2）操作规范 —— 实验需在生物安全柜中进行，接触病毒的耗材（如离心管、培养皿）需经高压灭菌处理，避免病毒泄露；操作人员需佩戴手套、口罩，防止气溶胶吸入，确保实验安全。

转染与病毒收集优化：转染时细胞汇合度需严格控制在 50%-60%，此时细胞转染效lü最高；病毒收集时间需在转染后 48-72 小时，过早收集滴度过低，过晚收集因细胞凋亡导致上清中含大量杂质，影响病毒质量；若需提高滴度，可采用 “多次收集法"（转染后 48h、60h、72h 分别收集上清，混合后浓缩），避免单次收集的局限性。

实验对照设置：开展基因转导实验时需设置多重对照 —— 空白对照（未感染细胞）、空载体对照（感染含无目的基因的病毒载体）、阳性对照（感染含已知功能基因的病毒载体），排除病毒载体本身、转染试剂对细胞表型的影响，确保实验结果的特异性；同时需通过 Western blot、qPCR 或报告基因检测，验证目的基因的表达效率，避免因表达过低导致实验结果假阴性。

上一个：Saos-2人成骨肉瘤细胞