Glycated hemoglobin A1c ELISA KIT

基本信息

• 用途：主要用于体外定量检测生物样本中糖化血红蛋白 A1c 的含量，通常用于科研领域，如糖尿病相关的基础研究、药物研发等，而不能直接用于临床诊断。

• 适用样本类型：常见的有血清、血浆、细胞培养上清液、组织匀浆、尿液、分泌物等。

检测原理

• 双抗体夹心法：以兔糖化血红蛋白 A1c ELISA 试剂盒为例，用纯化的糖化血红蛋白 A1c 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入糖化血红蛋白 A1c，再与 HRP 标记的糖化血红蛋白 A1c 抗体结合，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物，经过che底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的糖化血红蛋白 A1c 呈正相关，用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中糖化血红蛋白 A1c 浓度。

• 竞争法：如 Abbexa 公司的人糖化血红蛋白 A1c ELISA 试剂盒，是基于竞争酶联免疫吸附测定技术。先将抗体预包被到 96 孔板上，加入标准品、测试样品和生*素标记的试剂，生*素标记的糖化血红蛋白 A1c 和未标记的糖化血红蛋白 A1c 会在包被抗体上发生竞争抑制反应，再加入 HRP 标记的试剂，孵育后洗去未结合的结合物，加入 TMB 底物进行显色，颜色变化与糖化血红蛋白 A1c 的量成反比，通过测定 OD 值计算糖化血红蛋白 A1c 的浓度。

试剂盒组成

• 酶标包被板：通常为 96 孔或 48 孔板，表面预包被有特异性抗体。

• 标准品：已知浓度的糖化血红蛋白 A1c，用于制作标准曲线，以便根据样品的吸光度值计算其浓度。

• 酶标试剂：一般为 HRP 标记的抗体或其他酶标记的试剂，用于与抗原或抗体结合，产生可检测的信号。

• 显色剂：如 TMB 底物，在酶的作用下发生颜色变化，用于指示反应的结果。

• 终止液：用于终止显色反应，使颜色稳定，便于测量吸光度。

• 洗涤液：用于洗涤反应板，去除未结合的物质，减少非特异性结合的干扰。

• 样品稀释液：用于稀释样品，使样品中的糖化血红蛋白 A1c 浓度在试剂盒的检测范围内。

操作步骤

1. 试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，在室温平衡 15-30 分钟。按照说明书要求稀释洗涤液、配制酶标工作液等。

2. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上准确加入标准品和待测样品，加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育一定时间，使抗原与抗体充分结合。

4. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复多次，拍干，以去除未结合的物质。

5. 加酶：每孔加入酶标试剂，空白孔除外，然后进行温育。

6. 显色：每孔先加入显色剂 A，再加入显色剂 B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色一定时间。

7. 终止：每孔加终止液，终止反应，此时颜色会发生变化，如蓝色立转黄色。

8. 测定：以空白孔调零，在 450nm 波长下依序测量各孔的吸光度（OD 值），并根据标准曲线计算样品中糖化血红蛋白 A1c 的浓度。

注意事项

• 试剂盒保存：应按照说明书要求在 2-8℃条件下保存，避免冷冻和反复冻融，有效期一般为 6 个月左右。

• 操作规范：严格按照规定的时间和温度进行温育，所有试剂在使用前需达到室温 20-25℃。加样要准确，使用加样器并经常校对其准确性，一次加样时间最好控制在 5 分钟内。

• 避免污染：操作过程中要注意防止交叉污染，封板膜只限一次性使用，不同批号的试剂组分不得混用。

• 底物保存：底物显色液应避光保存，如发现底物液已经变蓝则不能使用。