Real-time PCR技术

一．    样品的RNA抽提（Trizol，Invitrogen）
 

1、样本处理

1）培养细胞：收获细胞 1-5×10 7 ，移入 1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol ，混匀，室温静置 5min。

2）组织：每50 - 100mg组织样品，用液氮研磨成粉末，加入1 ml的TRIZOL试剂，混匀，室温静置 5min。

2、两相分离

每1 ml的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡管体，室温静置 5min。4°C下12,000 ×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约使匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

3、RNA沉淀

将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1 ml TRIZOL试剂的此时加0.5 ml的异丙醇。混匀后15到30°C孵育10分钟后，于4°C 12,000 ×g离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

4、RNA清洗

移去上清液，每1 ml TRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1 ml的75%乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4°C 7,500 ×g离心5分钟。

5、重新溶解RNA沉淀

去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5 - 10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要*干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A_{260 / 280}比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60°C孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于- 70°C。

二．    RNA浓度与纯度测定

取1μlRNA样品稀释100倍后测定RNA浓度及OD260、OD280。纯的RNAOD260/280在1.8～2.0之间。样品RNA浓度计算公式为：A260 X 稀释倍数×40 ng/ul。

三．    RT（PrimeScript® RT reagent Kit  Perfect Real Time，Takara）

1、按下列组份配制RT反应液

2、反转录反应条件如下: 37℃ 15 min，85℃ 5 sec。

3、反应结束后，将其放在冰上待用或-20℃保存。

四．    qPCR（SYBR Premix Ex Taq，Takara）

1、按下列组份分别配制Realtime PCR反应体系。

轻弹管底将溶液混合，5000 rpm短暂离心。

2、步骤1配置的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。

95℃，5min；40个PCR循环（95℃，10秒；60℃，20秒；72℃，20秒；79℃，20秒（收集荧光））。

为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，（95℃，2min；60℃，20秒；72℃，20秒；99℃，15秒，并从72℃缓慢加热到99℃（8分钟）。

3、结果与计算

各样品的目的mRNA和内参（GAPDH）分别进行Realtime PCR反应。数据采用2 ^{- △△ CT}法进行分析

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