乾思带你认识CCK-8试剂盒

 产品简介： 

Cell Counting Kit简称CCK 试剂盒，为MTT法的替代方法，是一种基于WST（水溶性四唑盐，化学名：2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

CCK用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验。

优点：

1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT；5、对细胞毒性小；6、为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

缺点：

1、与MTT相比，CCK-8和XTT的价格比较贵。2、CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。

CCK-8试剂盒操作说明： 

一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时） 

1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。 

2、按比例（例如：1/2比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。 

3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间。）

二、细胞活性检测 

1、在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（在37℃,5% CO2的条件下）。 2、向每孔加入10 μL的CCK溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。 3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。 4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 

5、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。 三、细胞增值-毒性检测 

1、在96孔板中配置100μL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时（在37℃，5% CO2的条件下）。 2、向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。 

3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。12后/24h 4、想每孔加入10μL CCK溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。 5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。（2h后） 6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 

7、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。 

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。  备注： 

①建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK试剂后的培养时间。（怎么判断哪个时间好？） ②有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔减的差异。加入CCK试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基页面下加，容易产生气泡，会干扰OD值读数。 ③白细胞可能需要培养较长时间。 

④当使用标准96孔板时，贴壁细胞的zui小接种量至少为1,000 个/孔 （100 μL 培养基）。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 （100 μL 培养基）。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK溶液。 

⑤如果没有450nm的滤光片，可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片，但是450nm滤光片的检测灵敏度zui高。 

⑥培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。 

活力计算： 

细胞活力*（％）=[A（加药）-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100 A（加药）：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度 A（空白）：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度 A（0加药）：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度 *细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力 

保存条件： 

4℃干燥避光保存，有效期一年。

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