细胞培养知识

乾思 生物编辑整理：

1.如何选用培养基？

   培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的是AIM V培养基（SFM）。

 

2.为什么要热灭活血清？

   加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。 

 

3.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？

   它在溶液中不稳定吗？ L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有zui终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

 

4.GlutaMAX-I是什么？

   培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有zui小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎*降解。

 

5.为什么培养基中可以省去加酚红？

   酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

 

6.如何用台盼兰计数活细胞？ 

   用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。

 

7.如何消除组织培养的污染？

   当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

  1）在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。

  2）分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

  3）每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。

  4）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3代。

  5）在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

  6）重复步骤4。

  7）在无抗生素的培养基中培养4-6代，确定污染是否以已被消除。

 

8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？

   丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

 

9.Hank’s 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？

   Hank’s 平衡盐溶液（HBS）和Earle’s平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？ HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles （2.2g/L）中比在Hanks （0.35g/L） 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

 

10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别?

   Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测：End-Point Determination of Endotoxin Content噬菌体检验生物化学检测 激素的检测血红蛋白检测Sf9 细胞生长促进及方法学检测

 

11.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？ 

   二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。

 

12.制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率吗？ 

   是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀释试剂在100μl OPTI-MEM中，稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后，在复合物中加入含有血清的培养基（800μl）。（注意以上是35mm培养皿使用体积）。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体，接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。

 

13.我使用SF900 Ⅱ时，细胞生长良好，但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好？ 

   如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的*底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清（少于1％），让血清给蛋白酶提供作用底物。 

 

14.如何检测内毒素（热源）水平？

   LAL（Limulus Amebocyte Lysate）试验是可用的zui敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎（Limulus polyphemus）血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统（丝氨酸蛋白酶级联反应系统），通过修饰凝集素，产生一种透明的胶，LAL中的凝固蛋白，从而，形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎（血细胞）裂解物。胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island，按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前，用无热源的水1：10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟，以消除抑制剂。（通常，血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程，使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。）

 

 15.我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗？ 

   如果使用固体形式的培养基，需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌，应该高压灭菌琼脂溶液，然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。

 

16. 20℃下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下PH值会改变吗？

   对于普通使用的缓冲液，PH值随温度变化而变化。下表列出温度改变10℃时，PH值的变化情况例如 20℃下配制PH7.4 Tris缓冲液,40℃时PH值为 7.4-（2x0.310）＝6.7817. 室温下（25℃）配制的

 

17.Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少？

   缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同的PH值。

 

18. 昆虫细胞培养的zui适PH值和渗透压是多少？

   生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH值 6.0-6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的zui适渗透压是 345-380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。

 

19. High Five细胞有任何其它名称吗？

   High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

 

20.在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少？ 

   High Five无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。 

 

21.High Five细胞用多大的密度冻存？

   3.0x10E6 cells/ml 

 

22.在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀，加热后溶解。它是什么？对我的细胞有害吗？ 

   可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实验不会有不利的影响。 

 

23.如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗？ 

   我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性zui小，生活力zui高。通过使用巴氏德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：1）去除培养基。2） 用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS.3） 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。4） 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。5） 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。）6） 离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。7） 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。 

 

24.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？

   为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。 

 

25.如何评估ES细胞合格的胎牛血清？ 

   使用D3 ES细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。相关生长效率分析：当ES细胞以非常低的密度传入包含10％胎牛血清的生长培养基中，检测开始和支持ES细胞克隆的能力。细胞毒分析：当以非常低的密度传入包含30％胎牛血清的生长培养基中，检测ES细胞和feeder细胞的生长能力。相关形态学和分化分析：检测胎牛血清支持未分化ES细胞克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES细胞小颜色深红粉红，分化的细胞较大，丰满，颜色较浅。所有的分析在没有ESGRO的情况下进行的，培养基中出现ESGRO会掩盖由胎牛血清所导致的问题。（ESGRO或LIF经常用来保持ES细胞处于未分化状态。）经过培养发现，大约8批中有1批可以用来培养ES细胞。

 

26.在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？

   通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候记数时，都应该检查细胞活力。如果超过95％的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。

 

如何选用特殊细胞系培养基？ 

  培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养AIM V（12005）培养基（SFM）。 

 

L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ 

  L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有zui终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 

 

GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ 

  GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有zui小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎*降解。 

 

什么培养基中可以省去加酚红？ 

  酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 如何用台盼兰计数活细胞？ 用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/毫升，在0.1毫升的细胞悬液中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。 

 

如何消除组织培养的污染？ 

  当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。 高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。 1. 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。 2. 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。 3. 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。4. 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。 5. 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。 6. 重复步骤4。 7. 在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。 

 

培养基中丙酮酸钠的作用是什么？ 

  丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

 

无菌操作基本技术 

1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台（laminar flow） 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70% ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70% ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 

2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70% ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 

3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 

4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少Class II）。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 

5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网（300小时/预滤网，3000 小时/HEPA）。 

6. 水槽可添加消毒剂（Zephrin 1:750），定期更换水槽的水。

 

实验用品 

1. 种类? 

  1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。 

  1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。 

  1.3. plastic sterile pipet: 1ml, 2ml,5ml, 10ml, 25ml 

  1.4. 塑料离心管: 15ml, 50ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene （PP） 为不透明材质，polystyrene （PS） 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 

  1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 

  1.6. 玻璃血清瓶（Pyrex or Duran glassware）：100ml, 250ml,500ml,1000ml 

 

2. 清洗? 

  2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。

  2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。

 

3. 灭菌? 

  3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，置于oven 中烘干。 

  3.2. 实验用玻璃pasteur pipet 以干热灭菌170℃, 4 小时。   

  3.3. 液体或是固体废弃物可用10% hypochloride 溶液（次氯酸，即漂白水） 或是蒸汽高压灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟处理。

 

培养基 

1. 液体培养基贮存于4℃冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃水槽中温热。 

2. 液体培养基（加血清） 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。 

3. 粉末培养基配制（以1 升为例）： 

   3.1. 细胞培养基通常须添加10% 血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml，pH 为7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸（HCl）或强碱（NaOH），因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。  

   3.2. 材料： 

    3.2.1. 纯水（milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要） 

    3.2.2. 粉末培养基 

    3.2.3. NaHCO3 （Sigma S-4019） 

    3.2.4. 电磁搅拌器 

    3.2.5. 无菌血清瓶 

    3.2.6. 0.1 或0.2 mm无菌过滤膜 

    3.2.7. pH meter 

    3.2.8. 真空帮浦 

    3.2.9. CO2 气体

  3.3. 步骤： 

   3.3.1. 取粉末培养基溶于700ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。 

   3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末（数量依培养基种类而异，表一）溶于200ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5 分钟。 

   3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH 会升高0.1-0.2。 

   3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。（血清亦可加入培养基中一起过滤） 

   3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。 

4. 配制培养基之生长测试 

   4.1. 材料： 

    4.1.1. MDCK cell （ATCC CCL-34 或CCRC 60004） 4.1.2. 6-well TC plate （or 35 mm TC dish） 

    4.1.3. methanol 

    4.1.4. glacial acetic acid 

    4.1.5. 10% Giemsa solution （GibcoBRL 10092-013） 

    4.2. 步骤： 

    4.2.1. 以待测试培养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate （或35mm TC dish） 中，每个well 接种1 × 102 活细胞，同时作对照组实验。 

    4.2.2. 接种5～7 天后，在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。 

    4.2.3. 去除培养基，加入1ml Carnoy’s 固定液（甲醇：冰醋酸? 3:1），室温下静置10 min。 

    4.2.4. 去除固定液，水洗二次。 

    4.2.5. 加入1ml 10% Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。

    4.2.6. 去除染液，水洗二次。

    4.2.7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。