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平滑肌细胞原代培养方法
动物:大鼠150～180g,2～3只
操作步骤
大鼠颈椎脱臼致死
固定
消毒胸腹部
大组织镊,组织剪切开胸腹部皮肤
另一组织镊,组织剪切开胸腹部,并切除部分胸壁以利暴露
眼科镊和眼科弯剪分离胸腹主动脉并放入盛有Hank's液的细胞培养皿中,转入无菌室.或先用生理盐水漂洗,再放Hank's液中,转入无菌室
眼科直镊和弯镊去除血凝块和血管外膜层.
放入另一盛有Hank's液的细胞培养皿中,剪去血管外的小分支
放入含20%胎牛血清的DMEM中,眼科直剪剪开血管腔,以眼科弯镊轻轻擦拭内膜层,以去除内皮细胞
放入另一含20%胎牛血清的DMEM中,用眼科弯剪剪碎血管组织至1mm
用吸管把组织块转入玻璃培养皿中,均匀贴壁,组织块的间距为0.5cm
盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上,并向瓶内注入适量培养液,于37 C孵箱内放置4～5小时,使得组织块干涸,并与瓶底贴附
将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块*浸入培养液中,继续静置3～5天,切勿移动.待有细胞从组织块周围游离出后换液
平滑肌细胞传代
传代时间:大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞晕相接触时就可以传代
传代步骤:
倒掉培养瓶中的培养液
用D-Hank's液洗两遍
加2-3滴0.25%胰蛋白酶消化液,平放培养瓶,在倒置纤微镜下观察细胞消化情况,可见到细胞质回缩,细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶,使细胞脱离消化液
注意:
初次传代对胰酶敏感,加入消化液30s,即消化充分,以后2分钟左右
细胞消化完成后,用吸管反复抽吸打散细胞
中止消化:加入DMEM培养液3滴管,用吸管反复吹打瓶壁细胞
离心:1500 X5分钟
倒掉液体,加D-Hank's液洗一次,再加10mL DMEM培养液,用吸管抽吸吹打分散细胞,分装于2个培养瓶.在倒置纤微镜下可见圆形细胞.放入细胞培养箱中培养
血管平滑肌细胞的冻存和复苏
冻存时间:较早期传代,以防细胞因为传代次数过多而造成细胞衰老或发生改变,以保持实验条件的一致性.
冻存方法:冻存前24小时更换培养液,冻存时要将密闭好的冻存管依次放于:
4 C 2小时
-20 C 2.5小时
液氮表面 2小时
浸入液氮
培养细胞的鉴定
1,形态学鉴定:
用相差显微镜常规观察细胞生长形态以及生长规律.并依据常规制作电镜标本进行观察
电镜观察结果:细胞形态不规则,胞浆内有肌丝,纵向排列,有密区,具备平滑肌细胞特征
2,免疫组织化学鉴定:
特异性鼠抗α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体,采用SP法对细胞爬片进行免疫组织化学染色
免疫组织化学鉴定结果:
镜下观察到细胞爬片,可见细胞浆内大量平行阳性染色胞核不着色.所有细胞染色,结果均为阳性
培养试剂的配制
Hank's液 （单位g）
CaCl2 0.14
KCl 0.4
KH2PO4 0.06
MgSO4.7H2O 0.10
NaCl 8.0
NaHCO3 0.35
Na2HPO4.12H2O 0.12
D-glucose 1.0
Phenol red 0.01
将 CaCl2先溶解在100mL的ddH2O中,其它成分溶在750 mL的ddH2O中,混匀（用磁力搅拌器搅拌至溶解）,定容至1000mL.高压蒸气消毒10分钟,4℃冰箱保存.
D-Hank's液 （单位:g）
KCl 0.40
KH2PO4 0.06
NaCl 8.0
NaHCO3 0.35
Na2HPO4.12H2O 0.08
Phenol red 0.02
将以上成分溶于900mL ddH2O中,充分混匀,加ddH2O至1000 mL.高压蒸气消毒10分钟,4℃冰箱保存.
青霉素,链霉素液配制
青霉素80万U加Hank's液至80 mL,终浓度1万u/ mL
链霉素100万U（相当于1g）加Hank's液至100 mL,终浓度10mg/mL
分装后至-20℃冰箱保存.
DMEM培养液
900 mL ddH2O于1000 mL容器中,将DMEM粉1包倒入容器中,盛粉袋用50 mL ddH2O分次冲洗,也倒入容器,磁力搅拌溶解.
加NaHCO3
调PH至7.2
加青,链霉素至终浓度100u/mL 和100ug/mL
0.22umX50滤膜过滤（负压泵抽吸）,4℃冰箱保存.
小牛,胎牛血清灭活
55℃水浴箱30分钟,置4℃冰箱保存
灭活前放于-20℃冰箱保存待用
临用前加入DMEM液中
血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCS ）位于动脉壁中膜，它对管壁的完整性和调节血管的紧张性起着重要作用.在经典的单层培养系统中，VSMCS 离开了在体内与细胞外基质共同构成的三维立体生长环境，因而所表现出的生物学特性与在体状态存在较大的差异.我们在VSMCS 单层培养的基础上，将兔主动脉VSMCS 置于胶原凝胶中，使其在体外与细胞外基质形成一个整体，观察其在三维状态下的生物学特征，为构造结构和功能与在体血管中膜相似的中膜组织，zui终形成组织工程化血管提供实验依据.
动脉平滑肌细胞的培养
一、血管平滑肌细胞的培养
血管平滑肌细胞培养常用的方法有贴块法（explant）和酶解离法（enzyme disperse）。贴块法具有获得平滑肌细胞纯度高，量多，操作简便的优点。但用贴块法易使平滑肌细胞胞质内肌丝丧失，亚细胞器增加。相反，酶解离法，由于酶的作用使细胞间失去连接，细胞内肌丝含量丰富，保持收缩型状态。培养平滑肌细胞常取材于兔、猪、鼠、猴的胸腹主动脉段。
1．贴块法
方法：动物经颈动脉放血后，在无菌操作下迅速取出胸腹主动脉段，置于含Hank's液的平皿中漂洗3次，将凝块洗干净后剥除外膜的纤维脂肪层，然后纵行切开血管，刮除内膜即内皮细胞迅速撕下中膜内、中层，切成约1mm宽的小条，浸泡在含血清的Hank's液中，并将撕下小组织块种植于培养瓶壁。置于37℃恒温箱，2h左右，取出培养瓶加入20%胎牛血清的培养液，再放回培养箱内静止培养4天。4天后可见细胞从组织中迁移游出。
不同动物血管结构有差异，猪和猴较易操作，但小动物如兔、鼠因其血管小，血管壁薄等特点，使之难以分离。另外组织块太薄，不易粘附培养基，也使细胞较难生长。为了保证培养的成功，应注意：①种植组织块的数目，如75cm2的长颈瓶组织块不得少于30 ；②根据培养细胞的种属加入适量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，应加胎牛血清（FBS），通常浓度为10%～20%；③培养基的选择：常用的有DMEM（Dulbecco's modified Eagles'medium），M199培养基。培养兔的平滑肌细胞用DMEM效果较好。
2．酶解离法
沿动脉纵轴切开后，刮除内皮细胞撕下中膜的内2/3，注意不要混入内皮细胞，将组织块切成1-2mm2，放入加有3mg/ml胶原酶的无血清M199培养基中，37℃，0.5～1.5h。离心去上清，重复上述消化步骤，然后再离心（9000r,4min），收集细胞，在5%～10%同种血清或胎牛血清的M199培养基中调整细胞数，然后转入30～90mm培养皿中培养，对于兔子应加入高浓度的谷氨酰胺（0.2g/L）较佳。不同研究者在培养基、酶浓度以及消化时间等的选择都有很大的差异。
二、动脉平滑肌的特性
由于贴块法和解离法处理方式不同，在细胞培养的zui初阶段细胞形态和性质存在差异。随着培养时间的延长，培养环境趋于一致，细胞特性上也趋于近似。
光学倒置显微镜下观察：原代平滑肌细胞形状多样，一般常为梭形、带形、三角形或星形。贴块法培养，细胞可于2周后长成单层；而酶解离只需6～7天，镜下可见明显“峰-谷”样生长。
透射电子显微镜下观察：贴块法，细胞多为合成型，肌丝减少，胞体缩小，细胞胞质内粗面内质网、游离核糖体、线粒体等亚细胞器逐渐增多。消化法，细胞初期表现为收缩型，细胞内核位于中心，胞质内含丰富的肌丝及致密度体。亚细胞器少，且位于细胞边缘处，基底膜zui初未见，后来逐渐形成。传代后，细胞逐渐转为合成型，胞体增大且变扁平，核增大，核小体数目增加，亚细胞器也增加，肌丝开始减少，占胞内35.4%～11.5%,甚至更少。
另外，在体外实验中，来自幼龄动物（兔，猪）的血管平滑肌增殖生长早且快，相反，老龄动物则生长缓慢。在生化性质方面，收缩型细胞比合成型细胞的β-极密度脂蛋白（β-VLDL）对其受体结合能力强，低密度脂蛋白（LDL）分解降低，即脂质容易在胞质沉着。此外，像基底膜中的肝素样物质、胆固醇代谢等也有改变。合成型细胞内色素C氧化还原酶成倍增加，酸性磷酸酶亦呈3～4倍增加，说明两类细胞不仅在形态学上，在生化、生理反应方面也发生了较大改变。
