G蛋白偶联受体很久以来一直被认为是以单体的形式存在，并且与配体结合进行信号转导的。然而，近年来，越来越多的实验证据表明，有的GPCR可形成同源二聚体或异源二聚体而发挥作用。虽然这种聚集在与G蛋白结合方面的作用还存在争议，但是许多GPCR确实可形成二聚体/寡聚体是毋庸置疑的，尤其是C类受体（class C receptor）。二聚体/寡聚体除了可能参与G蛋白结合，还可能在GPCR脱敏、GPCR合成后从内质网分泌到细胞表面等过程中发挥作用。

二聚化/寡聚化的发现给新药研发提供了新的思路，尤其是对于异源聚集。在这种模式下，药物可能与一个GPCR结合，并共同活化了第二个GPCR，引起细胞反应。如果我们只用其中一个GPCR去做筛选，很可能看不到有意义的结果。同时，受体聚集的提出，给孤儿受体（orphan GPCR）也提出了新的解释。或许，这些孤儿受体可与其它GPCR形成二聚体/寡聚体，作为parter，而不是以单体的形式发挥作用。

有两个不同的方向进行受体二聚化/寡聚化检测，一个是体外检测，一个是活细胞检测。CO-IP是应用zui广泛的检测二聚化/寡聚化的体外方法。活细胞检测的方法主要基于能量共振转移（RET）原理，包括FRET、pbFRET 、BRET、HTRF（TR-FRET）等。Tag-lite将SNAP-Tag、HaloTag和HTRF技术结合起来，可以非常方便可靠地检测活细胞受体二聚化/寡聚化。

检测原理

同源二聚体的检测
构建SNAP和GPCR的共表达载体，转染入细胞，可表达SNAP-GPCR的融合蛋白。然后，加入分别标记了Tb和Acceptor荧光染料的底物，则部分GPCR标记了Tb（Tb-GPCR），部分标记了Acceptor荧光染料（Acceotor-GPCR）。如果GPCR可以形成同源二聚体，配体刺激后，两个GPCR会相互靠近并偶联。Tb-GPCR与Acceptor-GPCR之间发生能量共振转移，检测到HTRF信号，见图1。

图1：GPCR同源二聚体检测模式

异源二聚体的检测
分别构建SNAP-GPCR1和CLIP-GPCR2的表达载体，共转染，可得到表达SNAP-GPCR1和CLIP-GPCR2的细胞。加入标记了Tb的SNAP底物和标记了Acceptor荧光染料的CLIP底物，细胞表面的受体为Tb-SNAP-GPCR1和Acceptor-CLIP-GPCR2。如果GPCR形成异源二聚体，配体刺激后，GPCR1/2相互靠近发挥作用。Tb与Acceptor之间发生能量共振转移，检测到HTRF信号，见图2。

HaloTag与SNAP相似，也是一个自身标记的酶，通过与标记了荧光的底物反应，将自身标记上荧光。在这个实验中，我们也可以构建HaloTag与GPCR的表达载体。

检测特点和优势
• 活细胞水平的检测
• 检测背景低：时间分辨荧光的检测方式，没有荧光染料自身的交叉干扰和来自样品自发荧光的干扰
• 实验结果可靠：FRET技术使检测结果反映的是真正的受体聚集，而不是仅仅相互靠近
• 不需要抗体：Tag-lite利用的SNAP技术，不需要抗体来确定实验的特异性

应用领域
• 受体二聚化/寡聚化分析
• 孤儿受体的研究

应用实例

C类GPCR：GPCRGABAB1与GABAB2的异源二聚化检测
分别构建GABAB1与SNAP-Tag和GABAB2与HaloTag的表达载体，共转染细胞。蛋白表达后，固定SNAP的底物BG-Tb浓度不变，配制不同浓度的HaloTag的底物Halo-Red浓度，将两种底物混合后加入细胞。孵育1h后，检测HTRF信号，实验结果如图3所示。

GABAB1与GABAB2形成异源二聚体发挥作用。随着Halo-Red浓度的加大，有更多的能量从Tb转移到Red染料上，HTRF信号增强，直到达到平衡。

图3：GABAB1与GABAB2的异源二聚化检测

A类GPCR：多巴胺D2与Delta 阿片的异源二聚化检测
分别构建Delta阿片与SNAP-Tag和多巴胺与HaloTag的表达载体，共转染细胞。蛋白表达后，固定SNAP的底物BG-Tb浓度不变，配制不同浓度的HaloTag的底物Halo-Red浓度，将两种底物混合后加入细胞。孵育1h后，检测HTRF信号，实验结果如图4所示。

图4：GABAB1与GABAB2的异源二聚化检测

多巴胺D2与Delta阿片形成异源二聚体发挥作用。随着Halo-Red浓度的加大，有更多的能量从Tb转移到Red染料上，HTRF信号增强，直到达到平衡。